不同時(shí)間滴鼻免疫小鼠對可溶性速殖子抗原的阻斷作用

不同時(shí)間滴鼻免疫小鼠對可溶性速殖子抗原的阻斷作用

新地快蟲是一個(gè)全球分布的系統(tǒng)，在廣泛寄生于文血?jiǎng)游锏奶厥饧?xì)胞中，導(dǎo)致原生動物的共病，導(dǎo)致人類疾病。免疫功能正常者多為隱性感染,孕期感染可通過胎盤垂直傳播給子代,或?qū)е铝鳟a(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)及胎兒先天性弓形蟲病等異常妊娠結(jié)局。本病尚無有效防治藥物,研制有效的弓形蟲疫苗迫在眉睫。近年來,國內(nèi)外學(xué)者對于弓形蟲先天性感染的疫苗研究取得顯著進(jìn)展?？扇苄运僦匙涌乖?STAg)單獨(dú)或聯(lián)合包囊抗原皮下免疫小鼠可降低胎鼠的死亡率。單聯(lián)喆等給感染弓形蟲孕鼠腹腔注射一定劑量的rhuIL-2,可使活胎數(shù)增加、垂直傳播率降低。Haumont等用重組SAG1核酸疫苗于孕前2周免疫豚鼠,孕期感染弓形蟲速殖子,疫苗組胎鼠感染率為14%,對照組為86%。上述研究表明疫苗能減低弓形蟲垂直傳播的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)STAg有較好的免疫原性,并已建立弓形蟲經(jīng)口感染的垂直傳播動物模型。本研究采用STAg于妊娠前不同時(shí)間滴鼻免疫BALB/c小鼠,觀察誘導(dǎo)的孕鼠免疫反應(yīng)、抗感染作用及對胎鼠的保護(hù)作用,為研制阻斷弓形蟲垂直傳播疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1弓形蟲、rh株BALB/c小鼠引自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所,微生物級別為二級。引入后二級動物室內(nèi)近交繁殖。國際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒RH株弓形蟲,引自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部寄生蟲學(xué)教研室,本室液氮保種。常規(guī)復(fù)蘇的速殖子腹腔接種BALB/c小鼠,轉(zhuǎn)種3代,收集腹腔沖洗液,洗滌凈化后計(jì)數(shù)速殖子,用于STAg制備和攻擊孕鼠。1.2妊娠合并心臟病陰栓感染時(shí)間5-6周齡BALB/c雌鼠130只,有交配經(jīng)驗(yàn)的BALB/c雄鼠20只。將處女鼠隨機(jī)分為STAg組和PBS組,分別以STAg(20μg/只)和PBS(20μl/只)滴鼻免疫2次,間隔2周。末次免疫后雌雄鼠以2∶1分批交配,每日清晨觀察陰栓,發(fā)現(xiàn)陰栓當(dāng)日為妊娠第0天。STAg組和PBS組各獲得孕鼠30只,按末次免疫時(shí)間的不同各組分為3小組(每組10只),分別為妊娠前3,9,15d末次免疫,即PBS3、PBS9、PBS15組和STAg3、STAg9、STAg15組。妊娠第8天用8000個(gè)/只速殖子灌胃攻擊各組小鼠。于妊娠第18天頸椎脫臼處死,記錄孕鼠健康狀況、活胎率,ELISA法測定孕鼠小腸沖洗液sIgA水平,以及孕鼠肝、胎盤和胚胎腦組織弓形蟲抗原。1.3stag生產(chǎn)將弓形蟲RH株速殖子洗滌凈化后,按照文獻(xiàn)方法制備STAg,-20℃保存?zhèn)溆?用于滴鼻免疫和酶標(biāo)板包被。1.4觀察胚胎發(fā)育情況妊娠第18天頸椎脫臼處死孕鼠,剖腹并切開子宮,觀察胚胎發(fā)育情況(計(jì)數(shù)活胎、死胎、吸收胎,計(jì)算平均活胎率,平均活胎率=活胎數(shù)/總胎數(shù)×100%)。1.5小鼠沖洗液制備開腹游離小腸,剪取幽門至回盲部小腸段,剪成約3cm小段,3mlPBS反復(fù)沖洗腸腔,收集小腸沖洗液,離心取上清,-20℃保存?zhèn)溆?。ELISA法測定小腸沖洗液sIgA水平。1.6鼠腦的制備取孕鼠肝中葉0.2g,全胎盤,胎鼠腦,制備勻漿液,2500r/min(700×g)取上清,-20℃保存?zhèn)溆谩LISA檢測弓形蟲抗原。1.7統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,孕鼠感染率、活胎率、胎盤及胚胎感染率的比較采用χ2檢驗(yàn),其他指標(biāo)比較采用單因素方差分析。2結(jié)果2.1妊娠合并心臟病感染情況PBS組孕鼠在攻蟲后第8天均出現(xiàn)豎毛、倦怠、腹部塌陷,飲水進(jìn)食減少等異常表現(xiàn),STAg組僅有少數(shù)第7-8天出現(xiàn)輕微豎毛、倦怠。實(shí)驗(yàn)期間PBS組死亡3只,STAg組死亡1只,各組死亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過ELISA檢測孕鼠肝臟弓形蟲抗原,分析孕鼠感染情況發(fā)現(xiàn),PBS組據(jù)妊娠前免疫時(shí)間的不同,感染率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;STAg組感染率逐漸降低,STAg15組感染率最低,STAg組均較相應(yīng)PBS組降低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,表1)。2.2前后前末次免疫后時(shí)間PBS組各時(shí)間點(diǎn)小腸沖洗液sIgA水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,STAg組隨著妊娠前末次免疫后時(shí)間推遲,sIgA水平逐漸升高,STAg15組高于STAg3(P<0.05)和STAg9(P>0.05)。STAg各組均高于相應(yīng)PBS組,其中STAg15組明顯高于PBS各組(P<0.05,見圖1)。2.3妊娠合并妊娠后活胎率通過胚胎發(fā)育情況觀察,發(fā)現(xiàn)各組均有不同程度異常妊娠發(fā)生。PBS組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)間無明顯差異,STAg組隨著免疫后妊娠時(shí)間推遲,活胎率增加,與STAg3和STAg9比較,STAg15組最高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。STAg3、STAg9組活胎率均高于相應(yīng)PBS組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),STAg15組活胎率高于PBS15組(P<0.05,見表2)。2.4體外染率及胚胎和胚胎感染率PBS各組胎盤感染率和胚胎感染率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,STAg組胎盤感染率和胚胎感染率均呈減少趨勢,但各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。STAg組胎盤和胚胎感染率均低于相應(yīng)各時(shí)點(diǎn)PBS各組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組胎盤感染率高于胚胎感染率,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表3)。3stag免疫的影響已有研究證實(shí)STAg滴鼻免疫可提高小鼠抵抗弓形蟲感染能力。黏膜免疫應(yīng)答發(fā)生的標(biāo)志是sIgA的產(chǎn)生,sIgA是黏膜免疫反應(yīng)中的保護(hù)性抗體,具有抑制外源性抗原分子的侵入、中和胞外病原微生物、結(jié)合抗原形成免疫復(fù)合物等清除病原體作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到,STAg滴鼻免疫提高了孕鼠小腸沖洗液sIgA特異性抗體水平,尤其是妊娠前15d免疫,抗體水平顯著高于對照,并高于3d和9d免疫組。通過攻蟲實(shí)驗(yàn),觀察到STAg免疫后孕鼠感染率均降低,妊娠前15d免疫感染率最低(P>0.05),死亡率同樣降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這可能是由于樣本量少。殷國榮等用STAg聯(lián)合霍亂毒素滴鼻免疫誘導(dǎo)小鼠黏膜及系統(tǒng)的免疫反應(yīng),且抵抗弓形蟲感染。說明在妊娠前15d用STAg滴鼻免疫小鼠能有效誘導(dǎo)孕鼠黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答,并提高孕鼠抗弓形蟲感染能力。STAg滴鼻免疫能提高胎鼠的活胎率,降低胎盤和胚胎感染率,減少垂直傳播的發(fā)生。Ismael等用Mic1-3KO免疫OF1小鼠,經(jīng)檢測免疫組垂直傳播率為4.6%,對照組為33.3%。Ali等利用LCV-IL-2重組體免疫Swiss小鼠,可使孕鼠及胎鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)反應(yīng),從而減少垂直傳播的發(fā)生。本研究觀察到STAg免疫后提高了孕鼠的活胎率,3d(50.00%),9d(64.52%),15d(73.33%)活胎率均高于對照,15d活胎率最高。通過胎盤和胚胎弓形蟲抗原的檢測,STAg免疫后胎盤感染率和胚胎感染率均呈減少趨勢,均低于PBS各組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),這可能是由于樣本量少的原因。但同時(shí)觀察到各組胎盤的感染率高于胚胎感染率,胎盤屏障可能起到了保護(hù)作用。Romand等發(fā)現(xiàn)孕期感染弓形蟲時(shí),外周、胎盤、胚胎的感染率依次呈下降趨勢,胎盤屏障起到了保護(hù)作