白的組培快繁研究

白的組培快繁研究

白鹿魚（tranb.）是一種昵稱白和、冰、地螺釘、利知子和植物的多年生草本植物。其塊莖具有補肺、消腫、生肌、止血、斂瘡等功效,用于治療肺傷咳血、金瘡出血、潰瘍疼痛、湯火灼傷、手足皸裂等癥。近年來,白芨不僅作為傳統(tǒng)中草藥和觀賞植物廣泛應(yīng)用,而且在化妝品的應(yīng)用中也日益受到重視。目前,白芨主要以采集野生自然資源為主,由于應(yīng)用范圍不斷擴展、用量不斷增加,其野生自然資源被過度采挖,儲量急劇減少。白芨種子不易發(fā)芽,主要以一分為二的分株方式進行繁殖,不僅繁殖率低、繁殖速度慢,而且耗種量大,還與用藥爭奪原料。采用組織培養(yǎng)技術(shù),可以快速繁殖大量種苗[4~6],以滿足人工栽培的需要。近年來,研究人員不僅對白芨資源的遺傳多樣性進行研究,還采用組織培養(yǎng)技術(shù)對其進行離體快速繁殖,繁殖系數(shù)高,育苗速度快,可為白芨人工栽培提供大量的種苗,減少對其野生自然資源的破壞。本試驗通過采用不同外植體、滅菌時間和激素組合等對白芨再生體系進行研究,探討適宜的培養(yǎng)基,為其快速繁殖提供參考。1材料和方法1.1試驗材料將廣西藥用植物園引進的白芨塊莖在室內(nèi)進行沙培,分別以其萌發(fā)側(cè)芽和塊莖為外植體進行培養(yǎng)。1.2滅菌時間用清水洗凈側(cè)芽和塊莖上的污物,再用洗衣粉溶液浸泡20min,清水沖洗后在超凈工作臺上,用75%酒精浸泡30s,再用0.2%升汞溶液分別滅菌,側(cè)芽滅菌時間分別為4、6、8、10min,塊莖滅菌時間分別為8、10、12、14min。經(jīng)滅菌后的側(cè)芽和塊莖用無菌水沖洗5~6次,切去側(cè)芽底端形成新的傷口,每個塊莖切成4~6份,分別接到培養(yǎng)基上,觀察不同滅菌時間的滅菌效果。1.3培養(yǎng)基的制備以MS為基本培養(yǎng)基,分別附加不同濃度6-BA(0.5~2.5mg/L)和NAA(0.1、0.2、0.4mg/L),并觀察不同激素組合對芽誘導(dǎo)和增殖的影響;采用1/2MS培養(yǎng)基并添加不同濃度NAA(0.2~1.5mg/L)進行生根培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基均含食用白糖20g/L,瓊脂5g/L,pH6.2。培養(yǎng)光照強度為1500~2000lx,光照時間12h/d,培養(yǎng)溫度25~28℃。2結(jié)果與分析2.1叢生芽的誘導(dǎo)以白芨側(cè)芽和塊莖分別為外植體進行組織培養(yǎng),結(jié)果表明,以側(cè)芽為外植體的培養(yǎng)效果較好。首先,側(cè)芽的滅菌效果比較好。側(cè)芽滅菌8min時成活率為92.6%,污染率僅為10.0%;塊莖滅菌12min的成活率為100%,但污染率為86.7%,滅菌14min污染率雖然下降為80.0%,但成活率也隨之下降為83.3%。其次,側(cè)芽恢復(fù)生長快,并且形成叢生芽需要的時間比較短。側(cè)芽在適宜的培養(yǎng)基上25d左右可形成叢生芽;塊莖在初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)15d左右,在莖節(jié)處形成1~2個圓形白色突起,接著從圓形突起周圍長出2~5條根,30d左右出芽,再培養(yǎng)20~25d,待芽約長到1cm時,切下來進行叢生芽誘導(dǎo)。由此可見,白芨塊莖滅菌比較困難,而且從接入培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)到叢生芽的形成所需要的時間較長,但不受季節(jié)限制,即使在白芨休眠時也可以作為外植體使用。2.2滅菌時間和污染率從表1看出,分別用4種不同時間對白芨側(cè)芽進行滅菌,隨著滅菌時間的延長,白芨側(cè)芽污染率降低,但成活率也隨之下降。滅菌6min時,雖然成活率為100%,但污染率高達63.3%;滅菌8min時,成活率為92.6%,污染率為10.0%;滅菌10min的污染率為6.7%,雖然有所降低,但成活率也下降,僅為78.6%。綜合來看,白芨側(cè)芽用0.2%HgCl2溶液滅菌8min為佳,既達到滅菌目的,又能保持白芨側(cè)芽的活力。2.36-ba濃度對火山灰火芽孢芽孢誘導(dǎo)率的影響將滅菌的白芨側(cè)芽接種于初代培養(yǎng)基中,培養(yǎng)30d。從表2看出,在0~1.5mg/L6-BA范圍內(nèi),從生芽誘導(dǎo)率隨其濃度增加而提高,芽長得粗壯;6-BA濃度為1.5mg/L時,誘導(dǎo)率為100%,芽粗壯;當6-BA濃度超過2.0mg/L時,叢生芽誘導(dǎo)率逐漸下降,芽變細弱。因此,在5種不同6-BA濃度的培養(yǎng)基中,6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L的效果較好,誘導(dǎo)的叢生芽多,芽粗壯。2.4-ba和naa對火炬松木納格蘭芽增殖系數(shù)的影響當初代誘導(dǎo)叢生芽長到1~2cm左右時,將其切分成單芽,接種到增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng),15d后在節(jié)間處出現(xiàn)一個個小突起,30d后長成叢生芽。從表3可知,在一定NAA濃度下,隨著6-BA濃度的增加,叢生芽增殖系數(shù)增高;當6-BA為2.0mg/L時,增殖系數(shù)可達5.0;當6-BA濃度為2.5mg/L時,增殖反而受阻,并且葉片出現(xiàn)焦尾現(xiàn)象。6-BA在與NAA配合使用時,以0.5~2.0mg/L6-BA、0.2mg/LNAA的增殖效果比較好,將NAA濃度提高到0.4mg/L時,增殖系數(shù)降低,芽基部的愈傷組織增多,苗細弱,葉色青黃。綜合各種情況來看,在繼代增殖培養(yǎng)基中,以6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L組合的效果較佳,叢生芽增殖系數(shù)較高,芽健壯,葉色翠綠。2.5不同濃度naa對白試管苗生根率、每株根數(shù)的影響當叢生芽長到3~4cm時,將其切成單芽接種于生根培養(yǎng)基中進行生根誘導(dǎo)培養(yǎng),培養(yǎng)40d后,結(jié)果表明(表4),不同濃度NAA對白芨試管苗生根率、每株根數(shù)均有影響,以NAA1.0mg/L的生根效果比較好,生根率較高,根數(shù)多,移栽時不易斷;當NAA濃度增至1.5mg/L時,生根率下降,根出現(xiàn)卷曲變形。2.6苗苗的煉苗和移栽當白芨組培苗在生根培養(yǎng)基上長有3條以上根時,將瓶苗置于室內(nèi)煉苗5d,再打開瓶蓋繼續(xù)煉苗2d,然后將小苗從培養(yǎng)瓶中取出,洗去粘附在根部的培養(yǎng)基,假植到沙床中3個月,再移栽到大田,成活率87.5%。3不同naa濃度對叢生芽的誘導(dǎo)效果外植體來源是影響白芨組培快繁的重要因素之一,選擇適宜的外植體,能縮短初代誘導(dǎo)的時間,達到事半功倍的效果。在本研究中,通過對不同外植體的滅菌效果和分化培養(yǎng)進行系統(tǒng)比較,結(jié)果表明,側(cè)芽是白芨進行組織培養(yǎng)的適宜外植體。主要是因白芨塊莖長期在地下受病菌和泥土污染,很難徹底滅菌,且經(jīng)分化培養(yǎng)后的分化率低,而白芨側(cè)芽的污染率較低,分化率較高。采用0.2%升汞在不同時間內(nèi)對白芨側(cè)芽進行滅菌,隨著消毒時間的延長,雖能降低側(cè)芽污染率,但側(cè)芽也因此受到嚴重傷害,降低其成活率,其中以0.2%升汞消毒8min為佳。在含一定NAA濃度的培養(yǎng)基中,添加不同濃度6-BA對叢生芽進行誘導(dǎo),以1.5mg/L6-BA的誘導(dǎo)效果最好。采用6-BA和NAA不同濃度組合對叢生芽進行增殖培養(yǎng),以2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA組合的增殖效果最好,增殖系數(shù)為5.0,比彭麗麗等使用2.5mg/L6-BA+1.5mg/LNAA組合得到的增殖系數(shù)2.0提高一倍多。NAA是影響白芨組培苗生根的主要因素,NAA濃度的高低對白芨試管苗生根率、生根數(shù)及根的粗細有