番茄組織培養(yǎng)的遺傳轉化及功能基因組學研究

番茄組織培養(yǎng)的遺傳轉化及功能基因組學研究

番茄是世界上重要的耕作植物，在植物生物學研究領域也發(fā)揮著重要作用。首先,由于番茄基因組較小、遺傳背景較清楚、易于遺傳轉化,番茄成為茄科模式植物;其次,番茄具有擬南芥、煙草和水稻等模式植物所不具備的果實成熟現象,因此番茄還是果實發(fā)育生物學研究的模式植物。番茄基因組測序工作已于2005年開始,已經測定的序列公布在/organism/1/genome(賀俊等,2008)。2011年5月11日,深圳華大基因研究院與荷蘭共同啟動了“100個番茄基因組研究計劃”。番茄功能基因組學研究的大幕正在拉開。對于功能基因組學和分子生物學研究,遺傳轉化是必不可少的試驗技術。目前番茄轉化的主要方法是結合組織培養(yǎng)的農桿菌介導法,因此建立簡便、高效的番茄再生體系,是深入開展番茄生物學研究的重要基礎。本文從培養(yǎng)條件、外植體選擇、再生中的組織形態(tài)學變化、體細胞變異等方面,綜述了番茄離體再生的研究進展。1影響番茄離子再生的主要因素1.1國內番茄栽培品種現狀番茄離體再生具有基因型依賴性(Matzke&Matzke,1998;El-Bakry,2002;Elluletal.,2003)。國內生產上番茄的栽培品種很多,已經有部分品種成功進行了組織培養(yǎng),比如中蔬(鮮豐)系列、麗春、櫻桃番茄等。Micro-Tom是近年來番茄研究中廣泛使用的試材。它是一種番茄突變體,保留了普通番茄作為模式植物的基本特征,但植株矮小、生命周期較短、可以高密度種植。因此,已被廣泛應用于番茄功能基因組學的研究(Meissneretal.,1997)。1.2不同品種番茄的再生頻率番茄組織培養(yǎng)中使用的外植體種類很多,有花藥、葉片、原生質體、子葉和下胚軸,其中用的最多的是子葉。不同品種、不同外植體的再生頻率各不相同。El-Bakry(2002)用含有不同濃度的6-芐基腺嘌呤(6-BA)和3-吲哚乙酸(IAA)的MS培養(yǎng)基,對10個不同番茄品種子葉的再生頻率進行了觀察。當6-BA和IAA的濃度為4.0mg·L-1和0.2mg·L-1時,5個品種的誘導率可達100%,Supermarmande誘導率最低,只有66.7%。1.3不同的生物酶學研究番茄組織培養(yǎng)通常使用MS培養(yǎng)基,從表1可以看出,玉米素(ZT)是使用較多的細胞分裂素。與人工合成的細胞分裂素6-BA相比,ZT誘導番茄再生的效率更高。以中蔬6號的離體再生為例,ZT和IAA組合的出芽率、正常芽率和增殖系數明顯高于6-BA與IAA的組合(于明禮等,2006)。陳麗萍等(2007)的研究也發(fā)現細胞分裂素ZT的不定芽誘導效果明顯優(yōu)于6-BA和激動素(KT),KT誘導效果最差,生長素IAA的不定芽誘導效果優(yōu)于吲哚丁酸(IBA)和萘乙酸(NAA)。植物的組織培養(yǎng)通常需要細胞分裂素和生長素配合使用,但曹慧穎和郭三堆(2005)、Sun等(2006)、Ehlert等(2008)、曹慧穎等(2009)在番茄再生誘導中僅使用了ZT,可見ZT對于番茄組織培養(yǎng)具有重要作用。1.4光周期對番茄再生的影響光對外植體的生長、分化具有重要影響。一般說來,黃化苗提供的外植體很難實現較好的再生(Bertram&Lercari,2000),白光比紅光或綠光更適于番茄組織培養(yǎng)(Schuetze&Wieczorrek,1987)。多數番茄組織培養(yǎng)試驗使用日光照16h的光周期,Bhatia和Ashwath(2005)系統研究了光周期對番茄再生的影響,結果表明光周期對番茄再生沒有顯著影響,最大芽再生率出現在日光照16h(60%),24h光照和24h黑暗條件下芽誘導率分別是40%和47%。而且Gresshoff和Doy(1972)發(fā)現番茄花藥培養(yǎng)中,不管光照條件如何,只要提供適當的培養(yǎng)基,花藥形成的愈傷組織都能分化。培養(yǎng)溫度也會影響番茄再生。番茄組織培養(yǎng)的常用溫度是25℃。當溫度不能控制在最適條件時,較低的溫度(19℃)比較高的溫度(28℃)更能促進莖外植體的再生(Reynoldsetal.,1982)。1.5最佳激素的測定番茄通過器官再生方式生成的不定芽,還需要生根變成完整的植株。多數關于番茄再生的文獻都研究了生根的最佳激素條件,一般使用濃度為0.05~0.5mg·L-1的生長素,發(fā)根率可達100%。陳火英等(2000)用不同濃度NAA、IAA、IBA、二氯苯氧乙酸(2,4-D)進行生根培養(yǎng)試驗,發(fā)現番茄的內源生長素濃度較高,添加生長素對不定芽發(fā)根有一定的作用,若不添加生長素也極易發(fā)根。2織化、扦插及細胞胚再生番茄的離體再生可通過器官發(fā)生和體細胞胚兩條途徑實現。已經報道的番茄再生體系多數都是器官發(fā)生,即首先從外植體上誘導愈傷組織,然后由愈傷組織分化不定芽,再將不定芽從基部切斷,扦插生根。陳火英等(2001)對鮮豐番茄離體培養(yǎng)中有關細胞啟動、分裂、分化以及器官發(fā)生做了細胞組織學觀察,發(fā)現不定芽通常發(fā)生在愈傷組織的周邊區(qū),也可起源于維管組織結節(jié)周圍,形成層狀細胞。體細胞胚再生途徑是類似于合子胚發(fā)育的途徑。關正君等(2011)以櫻桃番茄為試材建立了體細胞胚再生途徑,顯微觀察發(fā)現,體細胞胚發(fā)生不同步,但也經歷了球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉胚等階段。3細胞基因突變鑒定體細胞無性系變異是植物組織培養(yǎng)過程中的普遍現象,這些變異不一定都產生表型變化,但是可以從分子水平上鑒定。Nambisan等(1992)檢測了超過950株番茄再生植株,沒有發(fā)現標記位點表型變化;但是用葉綠素a/b結合蛋白cDNA序列雜交,17個檢測樣本中有2個出現了多態(tài)性。分子標記技術是廣泛應用的體細胞無性系變異鑒定方法。Soniya等(2001)利用RAPD技術檢測番茄再生苗,得到了15條非親本條帶,說明這些樣本發(fā)生了體細胞變異。李繼紅等(1999)利用RAPD技術在60個隨機引物中找到了4個可用于鑒定4個番茄品種體細胞無性系變異的引物。Bhatia等(2005)建立了番茄體細胞變異的AFLP檢測方法。雖然體細胞變異影響再生植株的遺傳穩(wěn)定性,但另一方面也可為育種開辟一條新途徑。Cano等(1996)、Rus等(2000)以NaCl作為選擇壓力,結合離體再生篩選出了番茄耐鹽突變體。4對番茄組織培養(yǎng)的研究作為一種重要的蔬菜作物,目前關于番茄組織培養(yǎng)的研究報道較多。番茄的組織培養(yǎng)相對比較容易,已經建立了許多器官發(fā)生途徑及部分體細胞胚再生途徑,但是深入的組織形態(tài)學研究較少,很多再生途徑不能確定再生細胞來源以及是否由單細胞發(fā)育而來。另外番茄組織培養(yǎng)的繁殖系數也有待提高。鑒于此,對于番茄組織培養(yǎng),今后應加強以下兩個方面的研究:(1)建立單細胞來源的體細胞胚再生途徑。番茄組織培養(yǎng)是遺傳轉化和功能基因組學研究的重要基礎,對于單細胞來源的再生植株,不產生