雞ac-細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

雞ac-細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

作為主體表面覆蓋的單層氣泡上皮細胞主要由氣泡上皮i組成（ac-iii）和i細胞（aec-iii）。AEC-Ⅱ細胞具有免疫調節(jié),肺表面活性物質的合成、貯存和分泌,肺泡更新和損傷修復,生物活性物質的代謝,離子轉運,肺泡液體量和成分的調節(jié),有類似“干細胞”的功能,可以分化為其他類型的上皮細胞。動物肺中有40多種細胞,從肺復雜的成分中得到高純度高產量的AEC-Ⅱ細胞,對進一步研究AEC-Ⅱ細胞有重要意義。1974年Kikkswa等首先用胰蛋白酶分離大鼠AEC-Ⅱ細胞;Dobbs等用彈性蛋白酶代替胰蛋白酶分離大鼠Ⅱ型細胞,經純化后AEC-Ⅱ細胞的產量可達89%;Leary用親脂性熒光素phosphine3R(熒光磷)標記AEC-Ⅱ細胞的板層體,結合細胞的光散射特征,分離得到的AEC-Ⅱ細胞含量可達90%;有報道,大鼠AEC-Ⅱ細胞培養(yǎng)24h后,板層體增多,細胞平展,但不分裂增殖;培養(yǎng)3d后,板層體退變,5d后,細胞特征已不能識別。用漂浮膠原支持物培養(yǎng)AEC-Ⅱ細胞,其形態(tài)可保持10d左右,但生化功能在早期發(fā)生改變和轉化。隨著研究深入,AEC-Ⅱ細胞在生理、病理狀態(tài)下的作用及分離、純化建立體外培養(yǎng)系統(tǒng)的研究較多,Corti等成功分離了小鼠AEC-Ⅱ細胞;Murphy等成功分離了豬、豚鼠及人AEC-Ⅱ細胞;郝嘉等成功分離了大鼠AEC-Ⅱ細胞;陳慧等成功分離了胎鼠AEC-Ⅱ細胞;但目前對AEC-Ⅱ細胞培養(yǎng)方法的研究還局限在哺乳動物,尚未見到有關禽類AEC-Ⅱ細胞培養(yǎng)方法的建立,并且由于AEC-Ⅱ細胞僅占肺細胞總數的14%～16%,消化分離肺組織所得AEC-Ⅱ細胞占細胞總數的比例少(40%～50%),需經繁瑣的純化過程才能達到研究要求。且AEC-Ⅱ細胞在培養(yǎng)過程中基本不分裂增殖,易發(fā)生代謝和形態(tài)學改變,培養(yǎng)后表型喪失快,基本不傳代,尚不能形成細胞株供研究用,給研究工作帶來諸多不便。本研究采用胰蛋白酶和Ⅳ型膠原酶聯(lián)合消化對18日齡雞胚肺組織進行消化,經差速離心和免疫黏附,獲得雞AEC-Ⅱ細胞純度可達90%以上,并用堿性磷酸酶染色法對AEC-Ⅱ細胞鑒定,從而在國內首次成功的建立了雞AEC-Ⅱ細胞體外培養(yǎng)和鑒定方法,旨在構建雞AEC-Ⅱ細胞作為細胞模型,為進一步研究禽流感等敏感病毒及其他致病因子對雞AEC-Ⅱ細胞的致病性奠定基礎。1材料和方法1.1dmem的制備1)18日齡SPF雞胚,購自北京實驗動物中心。2)DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司,胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司,胰蛋白酶購自Serva公司,Ⅳ型膠原酶購自北京中北林格生物技術有限公司,BCIP/NBT顯色劑盒購自博士德公司。DMEM基礎培養(yǎng)液:DMEM干粉1袋,NaHCO33.7g,HEPES4.77g,超純水1000mL完全溶解后,用1mol/LNaOH和1mol/LHCl將pH調至7.2,定容至1000mL。0.22μm微孔濾膜正壓過濾除菌,4℃保存?zhèn)溆?。DMEM完全培養(yǎng)液:87mLDMEM基礎培養(yǎng)液、谷氨酰胺2mL、雙抗1mL、FBS10mL。CMF-PBS液:NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO412H2O2.89g、KH2PO40.2g,加入900mL雙蒸水,攪拌溶解,pH7.4,定容至1000mL,濾紙過濾,分裝,101.33kPa(15磅)高壓15min滅菌,冷卻后4℃?zhèn)溆谩BS液:NaCl8g、KCl0.38g、Na2HPO40.2g、Tris3g,CaCl20.15g、MgCl20.1g,溶于1000mL三蒸水中,pH7.5,過濾除菌,-20℃?zhèn)溆谩龃媾囵B(yǎng)夜:100mLDMEM營養(yǎng)液中加入10mLDMSO和20mLFBS,現配現用。3)Model2300二氧化碳恒溫濕度培養(yǎng)箱(Sheldonmanufacturing,INC公司),超凈工作臺(美國制造),倒置顯微鏡(Nikon公司),高速臺式離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠)。1.2方法1.2.1亞子遺傳因子的分離、提取和原代培養(yǎng)1胰蛋白酶液的制備18日齡SPF雞胚,無菌取肺,剔除氣管、支氣管、小血管組織后剪成1mm3,移至無菌青霉素瓶,用CMF-PBS液混懸并吸棄上清,重復3～4次至液體清亮,用37℃預溫的25g/100mL胰蛋白酶洗1次。2胰蛋白酶消化肺組織的分離加入25g/100mL胰蛋白酶,置37℃水浴消化10min,每2min搖動1次。倒置顯微鏡下觀察,細胞分散成團或單個細胞,用吸管充分吹打均勻,移出消化好的細胞懸液,加等量的DMEM完全培養(yǎng)液終止消化;同法分別用25和1g/100mL胰蛋白酶消化肺組織各2次,每次5min,移出細胞懸液并終止消化;合并細胞懸液,吹打均勻后,200目篩網過濾,800r/min離心10min,棄上清;沉淀懸浮于1g/100mLⅣ型膠原酶消化液,37℃消化15min,800r/min離心10min,棄上清,加完全培養(yǎng)液懸浮沉淀。3無定模后培養(yǎng)細胞懸液接種培養(yǎng)瓶,37℃,5%CO2(體積分數,下同。)培養(yǎng)箱中培養(yǎng),孵育1h后,吸出未貼壁細胞懸液,800r/min離心8min,沉淀重懸于完全培養(yǎng)液并接種于培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng),重復3次,未貼壁細胞懸液離心后,用完全培養(yǎng)液重懸并接種在預先包被有免疫球蛋白G(IgG)的培養(yǎng)瓶中,37℃孵育,免疫吸附1h除去巨噬細胞。最后未貼壁的細胞經800r/min離心5min2～3次,完全培養(yǎng)液重懸,400目(38μm)篩網過濾,以除去AEC-Ⅰ(50～100μm),調整細胞含量為1.5×106/mL,接種至培養(yǎng)瓶中,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15～18h,棄除未貼壁的細胞,更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每天用倒置顯微鏡觀察其形態(tài)和基本生長情況并適時更換培養(yǎng)液,臺盼藍染色了解細胞成活情況。1.2.2細胞純化、培養(yǎng)堿性磷酸酶是AEC-Ⅱ細胞分化的標志物,適用于區(qū)別肺泡巨噬細胞。本試驗用一步法堿性磷酸酶染色對分離的AEC-Ⅱ細胞進行鑒定。擬行鑒定的細胞經純化后轉至帶有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。24h后取出蓋玻片,用0.01mol/L的TBS液洗5min,4次,快速風干;按1∶50用0.01mol/L的TBS稀釋濃縮的BCIP/NBT顯色劑,將上述新配置的顯色液滴加于蓋玻片上;室溫避光孵育20min;為使顯色的反差更加明顯,水洗后核固紅復染1min;于倒置顯微鏡下觀察。1.2.3細胞培養(yǎng)周期將細胞懸液用紅細胞計數板進行細胞計數,并用完全培養(yǎng)液稀釋至2×104/mL,稀釋后的細胞懸液接種至2塊24孔板中,在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。自細胞接種0時起,每24h取細胞計數,每次重復4孔,共計10次,不作計數的細胞孔每隔天換1次液。以培養(yǎng)時間為橫軸,平均細胞含量為縱軸,繪制生長曲線圖。1.2.4胰蛋白酶細胞培養(yǎng)細胞鋪滿單層,去除培養(yǎng)液,用CMF-PBS洗3次。加2mL25g/100mL胰蛋白酶溶液,37℃孵育,每隔2min在倒置顯微鏡下觀察1次直至細胞懸起(多數細胞已變圓)。加5mL完全培養(yǎng)液終止胰蛋白酶作用,用吸管吹打使細胞團散開。繼續(xù)培養(yǎng),將2mL上述的細胞懸液轉移至一個新的細胞培養(yǎng)瓶中,并加8mL新鮮的完全培養(yǎng)液。在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)?？沙掷m(xù)培養(yǎng)或擴增細胞。1.2.5亞甲基細胞的凍存和恢復1懸浮細胞不同比例鋪滿單層的原代細胞同1.2.4消化、分離成細胞懸液。4℃1000r/min離心5min,棄上清。用預冷的凍存培養(yǎng)液懸浮細胞,調整細胞數為3×106個/mL。將細胞懸液分裝于凍存管中(1mL/管),-20℃,冷凍2h;轉入-80℃過夜,然后轉入液氮中保存。2細胞培養(yǎng)和分離將液氮中的細胞凍存管取出,放入37～40℃水浴中使其迅速融化。細胞完全融化后,用70%酒精對管外壁消毒,離心,然后將細胞轉移至10mLDMEM完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。37℃培養(yǎng)過夜,使細胞貼壁。棄培養(yǎng)液,加入10mL新鮮的完全培養(yǎng)液,在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)。2結果與分析2.1aec-細胞的體外分離和培養(yǎng)本研究用25和1g/100mL的胰蛋白酶及1g/100mLⅣ型膠原酶聯(lián)合消化法獲得的原代AEC-Ⅱ細胞可達3×107個/胚,純度達90%以上。2.2aec-細胞毒性變化從原代AEC-Ⅱ細胞生長曲線(圖1)可以看出,AEC-Ⅱ細胞在接種后,其生長過程經歷了4個時期:適應期、對數生長期、平臺期和衰退期,整個過程持續(xù)10d左右。接種后18～24h,AEC-Ⅱ細胞大量貼壁,為圓形,呈島嶼狀生長,處于適應期;24～72h,細胞漿伸展呈多邊形,相互連接形成細胞單層;胞漿內有大量的細小顆粒,細胞核明顯(圖2),細胞處于對數生長期,此時堿性磷酸酶染色可見大部分細胞呈陽性反應;接種后第4天細胞數量達到高峰并進入平臺期,但胞漿內顆粒開始減少;接種后6～7d顆粒明顯減少,細胞特征無法辨認,細胞進入衰退期,堿性磷酸酶染色僅見少量陽性反應。結果表明,AEC-Ⅱ細胞在原代培養(yǎng)第24～72h內處于最佳生長狀態(tài),此時適合體外試驗研究。2.3紅色基因檢測AEC-Ⅱ細胞經堿性磷酸酶染色,胞漿內陽性反應物為深藍色呈典型的車輪狀分布,經核固紅復染后,核被染成紅色與深藍色的陽性反應物反差明顯,更易與其他細胞區(qū)別(圖3)。中性粒細胞也呈陽性,但細胞體積小,核呈分葉狀,可與AEC-Ⅱ細胞細胞區(qū)分;而巨噬細胞、淋巴細胞和其它細胞均為陰性。2.4實際細胞的形成時間AEC-Ⅱ細胞的傳代細胞貼壁時間早于原代細胞,接種后4h即可見零星貼壁;單層細胞形成時間也明顯早于原代細胞;而且傳代后細胞形態(tài)更加均一,純度提高。但F5以后的細胞貼壁率明顯下降,F6代細胞基本不貼壁。2.5亞甲基細胞的凍存和恢復用常規(guī)方法對AEC-Ⅱ細胞進行凍存、復蘇、細胞活性鑒定,發(fā)現活細胞數明顯減少,貼壁能力弱,且貼壁緩慢,不能形成單層細胞。3討論3.1胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合對肺間質細胞的作用由于雞胚肺小不適宜灌注消化,本研究將肺組織剪碎有利于消化。彈性蛋白酶分離AEC-Ⅱ細胞,獲得產量較高,對上皮細胞的消化分離更具有選擇性,對細胞的損傷亦較小,但其價格昂貴,活性不穩(wěn)定,有效作用時間短,容易降解。胰蛋白酶價格低廉,但濃度大、消化時間長,細胞容易失活。膠原酶僅對間質細胞有消化作用,對上皮細胞影響不大。本研究采用不同濃度的胰蛋白酶和Ⅳ膠原酶聯(lián)合、短時間、多次對剪碎的肺組織進行消化,所得細胞產量高,同時,由于消化時間短,作用溫和,減少了肺間質細胞的數量,從而提高了AEC-Ⅱ細胞純度,也減輕了胰蛋白酶對AEC-Ⅱ細胞的損傷,提高了細胞活力。本試驗在胰蛋白酶溶液加入0.02g/LDNaseⅠ可有效防止細胞聚集。另外,加快細胞分離速度,縮短操作時間,維持低溫條件也是提高細胞活性的必要條件。3.2aec-細胞純化肺組織中有40多種不同的細胞,經酶消化后得到的細胞懸液中,除AEC-Ⅱ細胞外,還含有成纖維細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和中性粒細胞等,需純化才能使AEC-Ⅱ細胞達到研究要求。AEC-Ⅱ細胞純化常用密度梯度離心、流式細胞儀分離、磁鐵吸附和貼壁選擇等方法,操作繁瑣,細胞含量低,易受損傷。本研究采用差速離心和免疫黏附法后的AEC-Ⅱ細胞純度達90%以上,傳代后的細胞純度還可提高5%。3.3抗aec-細胞分AEC-Ⅱ細胞的鑒定方法包括染色法、電鏡法和與單抗結合的流式細胞術,其中電鏡觀察最為可靠,但需精密儀器。丹寧酸染色法,適用于光鏡鑒定,但其穩(wěn)定性差,耗時長,試劑多,巨噬細胞有黑色顆粒,不易與AEC-Ⅱ細胞區(qū)別。最近報道,用SP-A免疫組化法可對AEC-Ⅱ細胞鑒定,但該法建立時間短,抗體來源困難。堿性磷酸酶是AEC-Ⅱ細胞分化的標志物,也是膜標志酶,適用于區(qū)別巨噬細胞,本研究采用堿性磷酸酶BCIP/NBT顯色試劑盒對AEC-Ⅱ細胞進行鑒定,該方法操作簡便,反應產物著色鮮艷,結果穩(wěn)定可靠,價格低廉。但剛