黃酮類藥物與牛血清白蛋白相互作用研究

黃酮類藥物與牛血清白蛋白相互作用研究

血清是人和動物血清中最豐富的蛋白質，與各種帶正、負電負荷物質和電中性材料相互作用。各種藥物進入人體首先與血清白蛋白結合,通過血漿的存貯和運輸,到達受體部位產生藥理作用。測定血清白蛋白的變化,可為疾病診斷、療效觀察提供有價值的資料及數(shù)據(jù)。因此,從不同角度研究以白蛋白為代表的蛋白質與具有生物活性小分子間的相互作用目前已成為藥物領域的研究熱點之一。熒光光譜法是研究生物大分子,特別是蛋白質與各種有機小分子、離子或無機化合物相互作用的重要手段。通過熒光光譜技術可以獲得蛋白質分子中熒光生色基團的種類、結構和所處微環(huán)境及其分布情況等有用信息,同時還可以得到外源物質與生物大分子相互作用的有關數(shù)據(jù)。黃酮類化合物是指以黃酮(2-苯基色原酮)為母核而衍生的一類黃色色素。其中包括黃酮的同分異構體及其氫化的還原產物,也即以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物。黃酮類化合物大多數(shù)具有藥理活性,木犀草素、芹菜素和葛根素均屬于黃酮類藥物,結構式見圖1。本工作通過熒光光譜方法研究了木犀草素、芹菜素和葛根素3種黃酮類藥物與牛血清白蛋白(BSA)間的相互作用,探討了其與BSA作用的機理、熒光猝滅常數(shù)以及與BSA作用的結合常數(shù)和結合位點數(shù)等信息。1試驗部分1.1配制0.0.0.0.0.5%10-1的緩沖溶液,在溶液中混溶。請如下做法RF-5301型熒光分光光度計;TB-85型恒溫水浴;pHSJ-4A型pH計。牛血清白蛋白(BSA)標準儲備溶液:稱取牛血清白蛋白(相對分子質量為65000)0.6500g,加5g·L-1氯化鈉溶液溶解,定容至100mL容量瓶,濃度為1.0×10-4mol·L-1。三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液:用0.20mol·L-1Tris和0.10mol·L-1鹽酸在試驗溫度下用0.50mol·L-1氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至7.40。木犀草素、芹菜素、葛根素標準溶液:用TrisHCl緩沖溶液為溶劑配成1.0×10-3mol·L-1,在0~4℃冰箱中保存。所用試劑均為分析純,水為雙重蒸餾水。1.2熒光光譜測定在10mL比色管中依次加入pH7.40的TrisHCl緩沖溶液2mL,1×10-4mol·L-1BSA溶液1mL,以及一定量木犀草素、芹菜素、葛根素標準溶液,用水稀釋至刻度混勻,在試驗溫度下恒溫1h,采用1cm石英比色皿,選擇激發(fā)波長為285nm繪制熒光光譜,以及Δλ為60nm或15nm同步熒光光譜,木犀草素與葛根素熒光測定中激發(fā)和發(fā)射通帶均為5nm,測定芹菜素激發(fā)和發(fā)射通帶為3nm。2結果與討論2.1譜圖的建立按試驗方法分別測定了木犀草素、芹菜素和葛根素濃度對牛血清白蛋白熒光光譜的影響,熒光光譜圖見圖2。由圖2可知:隨著木犀草素、芹菜素、葛根素濃度逐漸增大,牛血清白蛋白的熒光強度均逐漸降低,這是由于蛋白質中存在的色氨酸和酪氨酸,使其具有內源熒光,加入的外源性藥物木犀草素、芹菜素及葛根素與BSA之間產生相互作用導致BSA內源熒光強度有規(guī)律地降低。2.2熒光加強研究的靜態(tài)猝滅類型引起B(yǎng)SA熒光猝滅的原因可能有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。動態(tài)猝滅過程遵循Stern-Volmer方程。式中:F0和F分別為不存在和存在猝滅劑時熒光物質的熒光強度;[Q]為猝滅劑的濃度(mol·L-1);KSV為動態(tài)猝滅常數(shù)(即Stern-Volmer猝滅常數(shù),L·mol-1);Kq是由擴散過程控制的雙分子動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)(L·mol-1·s-1);τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命,生物大分子熒光平均壽命約為10-8s。靜態(tài)猝滅過程遵循下式關系:式中:Ks為靜態(tài)猝滅常數(shù)(即配合物的締合常數(shù))。隨溫度的升高動態(tài)猝滅常數(shù)增大,而靜態(tài)猝滅常數(shù)減小,可由此判斷熒光猝滅類型。在不同的溫度下,以F0/F對相應的[Q]作圖,可得到木犀草素、芹菜素、葛根素對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程及猝滅常數(shù),見表1。一般認為,各類猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)為2×1010L·mol-1·s-1,而從表1結果可知:木犀草素、芹菜素和葛根素對BSA熒光猝滅的猝滅速率常數(shù)Kq數(shù)量級均在1012以上,可以初步判斷加入木犀草素、芹菜素及葛根素導致BSA熒光猝滅過程是以靜態(tài)猝滅為主,又隨溫度升高Stern-Volmer方程的斜率減小,進一步表明該過程是以靜態(tài)猝滅為主。2.3f0-f/f對lg[q]的雙對數(shù)圖當小分子與大分子結合時其表觀結合常數(shù)Kb與結合位點數(shù)n由下式求出:分別在292K,311K溫度下做木犀草素、芹菜素和葛根素與BSA的lg(F0-F)/F對lg[Q]的雙對數(shù)圖,根據(jù)截距和斜率求得不同溫度的Kb和n,見表2。由表3可看出:木犀草素與BSA的結合位點數(shù)n接近2,說明木犀草素與BSA可形成兩個結合位點。而芹菜素和葛根素與BSA的結合位點數(shù)n接近1,表明芹菜素和葛根素與BSA的結合位點數(shù)n接近1。木犀草素、芹菜素和葛根素與BSA的結合常數(shù)均大于104數(shù)量級,表明木犀草素、芹菜素和葛根素與BSA之間有較強的結合作用,可以被蛋白質運輸和儲存。2.4溫度對牛血清白蛋白作用的影響藥物等有機小分子和蛋白質等生物大分子之間的結合力主要包括氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力等。根據(jù)反應前后熱力學焓變ΔrHm和熵變ΔrSm的相對大小,可以判斷藥物與蛋白質之間的主要作用力類型,在溫度變化不大時,反應的焓變ΔrHm可以看作一個常數(shù),通過熱力學公式:式中:K類似于在相應溫度T下Stern-Volmer方程中的猝滅常數(shù)KSV;R為氣體常數(shù),計算出不同溫度下木犀草素、芹菜素和葛根素與牛血清白蛋白作用的自由能變ΔrGm、焓變ΔrHm和熵變ΔrSm,見表3。木犀草素、芹菜素和葛根素與BSA的熱力學參數(shù)ΔrHm<0和ΔrSm>0,根據(jù)Ross等總結的判斷生物大分子與小分子結合力性質和生物大分子自身結合力性質的熱力學規(guī)律,推斷出木犀草素、芹菜素和葛根素與BSA之間的作用力是以靜電引力為主的。2.5forer偶極-偶極非輻射能量轉移的曲線根據(jù)F?rster偶極-偶極非輻射能量轉移理論,當供能體發(fā)射熒光,其熒光發(fā)射光譜與受能體的吸收光譜有足夠程度的重疊,且供能體與受能體之間的最大距離不超過7nm時,將會發(fā)生非輻射能量轉移,導致熒光猝滅,由此可求出小分子化合物和蛋白質分子的結合位置相對于發(fā)射熒光的基團之間的距離。據(jù)此理論,非輻射能量轉移效率E,供能體與受能體之間的結合距離R及臨界能量轉移距離R0之間有下列關系:式中:F和F0分別為存在和不存在受能體時供能體的熒光發(fā)射強度;K2為偶極空間取向因子;N為介質折射常數(shù);Υ為BSA的熒光量子產率,試驗條件下,K2取受能體和供能體各項隨機分布的平均值2/3,Υ取蛋白質中色氨酸的量子產率0.15;N取水和有機物折射指數(shù)的平均值1.334;J為給體熒光發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊積分,可表示為:式中:F(λ)是BSA在波長λ處的熒光強度;ε(λ)是受能體在波長λ處的摩爾吸光率。采用矩形分割法可以求出光譜重疊區(qū)域的積分值J,繼而求出R06,E和r的數(shù)值。根據(jù)木犀草素、芹菜素和葛根素在292K時與BSA的物質的量之比為1比1時的吸收光譜與熒光光譜的重疊圖(圖略),以F?rster偶極-偶極非輻射能量轉移機理,積分圖中光譜重疊部分,求得重疊積分值J,進而根據(jù)上式求出R0,E和r的值見表4。由表4可知:木犀草素、芹菜素和葛根素與BSA分子間的距離r<7nm符合能量轉移理論,說明木犀草素、芹菜素和葛根素與BSA是足夠靠近,其結合是通過非輻射能量轉移而促使蛋白質的熒光猝滅。2.5-l-110.110.1的熒光光譜由Δλ=15nm所作同步熒光光譜只顯示酪氨酸殘基的光譜特征,而Δλ=60nm的同步熒光光譜僅顯示色氨酸殘基的光譜特征。因芳香氨基酸殘基的最大發(fā)射波長與其所處環(huán)境極性有關,若最大發(fā)射波長改變,說明殘基所處的微環(huán)境發(fā)生了改變,由發(fā)射波長的改變可判斷BSA中芳香氨基酸殘基所處微環(huán)境的變化。在BSA濃度為0.1×10-5mol·L-1時,逐漸增加木犀草素、芹菜素和葛根素濃度,并逐步測定Δλ為15nm和Δλ為60nm時的同步熒光光譜圖。隨著木犀草素、芹菜素和葛根素的加入,酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光光譜峰均產生猝滅,其中木犀草素的加入導致酪氨酸殘基的熒光光譜峰位發(fā)生了紫移,色氨酸熒光光譜峰位置無明顯變化,表明木犀草素的加入使得酪氨酸殘基所處的微環(huán)境疏水性增加,親水性降低,而對色氨酸殘基微環(huán)境構象的改變不大;芹菜素的加入對酪氨酸及色氨酸熒光光譜的位置均無明顯移動,表明芹菜素對蛋白質分子構象的改變不大;葛根素的加入對酪氨酸殘基的熒光峰的位置