淺析羅丹明123分離的肝癌細(xì)胞系MHCC97亞群AFP的表達(dá)

淺析羅丹明123分離的肝癌細(xì)胞系MHCC97亞群AFP的表達(dá)【摘要】目的:羅丹明123結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC97進(jìn)行分選,檢測(cè)甲胎蛋白(AFP)在不同肝癌細(xì)胞亞群中的表達(dá)差異。方法:應(yīng)用羅丹明123結(jié)合FCM將人肝癌細(xì)胞株MHCC97分為Rholow和Rhohigh組,采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察AFP表達(dá)和含量。結(jié)果:Rholow組和Rhohigh組比較,AFP表達(dá)率有顯著性差異。結(jié)論:AFP在肝癌細(xì)胞亞群中表達(dá)有差異,Rho123結(jié)合FCM可以進(jìn)一步證實(shí)腫瘤的異質(zhì)性。

【關(guān)鍵詞】肝細(xì)胞癌異質(zhì)性羅丹明123

惡性腫瘤雖然是從一個(gè)發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞單克隆增殖而來的,但在生長(zhǎng)過程中,可能出現(xiàn)其生長(zhǎng)速度、侵襲能力、對(duì)生長(zhǎng)信號(hào)的反應(yīng)、對(duì)抗癌藥物的敏感性等方面的差異,而這種異質(zhì)性的特點(diǎn)正是惡性腫瘤容易復(fù)發(fā)及產(chǎn)生耐藥性的根本原因。瘤細(xì)胞異質(zhì)性及其所導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的改變,對(duì)了解腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性和指導(dǎo)有重要意義。近年來,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)可以獲得中具有原始干細(xì)胞特征的成體細(xì)胞,利用類似的方法可以將肝癌細(xì)胞分成2個(gè)不同特性的亞群,從而獲得具有原始干細(xì)胞特性的成體細(xì)胞。甲胎蛋白(AFP)是肝癌特異性最強(qiáng)的標(biāo)記物,但是也存在異質(zhì)性,臨床上常遇到良性肝病的AFP值明顯增高或是原發(fā)性肝癌AFP值偏低。AFP在肝癌組織中的差異表達(dá)有可能反映了肝癌組織中不同癌細(xì)胞在分化程度上的差異。我們應(yīng)用羅丹明123結(jié)合FCM對(duì)肝癌細(xì)胞系MHCC97分選為Rholow細(xì)胞及Rhohigh亞群,并對(duì)各亞群對(duì)AFP進(jìn)行差異性比較。

1材料和方法

材料MHCC97肝癌細(xì)胞(人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系)由上海復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所提供;DMEM培養(yǎng)基、/L胰酶為Gibco公司產(chǎn)品;小牛血清為四季青公司產(chǎn)品;Rho123為Sigma公司產(chǎn)品;小鼠抗人AFP單克隆抗體、羊抗小鼠IgG二抗免疫組化及DAB顯色試劑盒為北京中杉公司產(chǎn)品;DEPC水為Sigma公司產(chǎn)品;Rnase抑制劑、隨機(jī)引物及MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品;AFP引物為北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司產(chǎn)品;瓊脂糖、TaqDNA聚合酶、FACSAria流式細(xì)胞分選儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品;BX51熒光顯微鏡及DP70數(shù)字像攝影系統(tǒng)為Olympus公司產(chǎn)品;FR980A生物凝膠電泳圖象分析系統(tǒng)為復(fù)日公司產(chǎn)品。

方法

不同濃度Rho123染色的Rholow及Rhohigh細(xì)胞的分析MHCC97細(xì)胞常規(guī)消化,HBSS洗滌,制備成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞密度為1×105/L。等分細(xì)胞懸液,參考Rho123對(duì)線粒體膜電位測(cè)定的濃度(mg/L),分別做mg/L和mg/L2個(gè)濃度梯度,對(duì)照組加入維拉帕米,以未加Rho123作為陰性對(duì)照,37℃避光水浴30min,冰上5min終止染色,冰預(yù)冷HBSS洗滌細(xì)胞并重懸。480nm激發(fā)光源,檢測(cè)FITC通道,對(duì)數(shù)模式采集信號(hào)做一維散點(diǎn)圖,將低Rho123且維拉帕米組缺失的區(qū)域設(shè)定為Rholow細(xì)胞的“門”。

Rholow及Rhohigh細(xì)胞的分選①細(xì)胞染色:MHCC97細(xì)胞常規(guī)消化,HBSS洗滌,制備成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞密度為1×106/L。等分細(xì)胞懸液,2組均加入熒光染料Rho123根據(jù)上一步結(jié)果選擇合適終濃度,其中1組再加入維拉帕米,終濃度50mmol/L,37℃避光水浴30min,冰上5min終止染色,冰預(yù)冷HBSS洗滌細(xì)胞并重懸。②FCM檢測(cè)分選:480nm激發(fā)光源檢測(cè),對(duì)數(shù)模式采集信號(hào)做一維散點(diǎn)圖,將低Rho123且維拉帕米組缺失的區(qū)域設(shè)定為Rholow細(xì)胞的“門”,計(jì)算百分比,分選出Rholow細(xì)胞及Rhohigh細(xì)胞。

AFP免疫細(xì)胞化學(xué)分析采用SP方法,操作步驟參照SP試劑盒說明。AFPmAb濃度1∶100,DAB顯色,蘇木精復(fù)染。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒定為陽性,根據(jù)陽性細(xì)胞百分率分為:陽性細(xì)胞10%為(-),陽性細(xì)胞10%～25%為(+),26%～50%為(++),50%為(+++)。

學(xué)處理統(tǒng)計(jì)包分析,采用非參MannWhitney兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)。

2結(jié)果

Rholow及Rhohigh細(xì)胞的分析1mg/L和mg/L組單純加入Rho123組幾乎無低熒光拖尾,加入維拉帕米無明顯改就;mg/L組有一低熒光拖尾,而維拉帕米拮抗組此區(qū)有改變;mg/L組同樣有一低熒光拖尾,而維拉帕米拮抗組此區(qū)有明顯改變,該區(qū)比例為%,分別選取此濃度作為分選濃度(1)。

圖1Rholow及Rhohigh細(xì)胞分析的FCM分析

a:陰性對(duì)照;b:mg/L染色;c:mg/L＋維拉帕米;d:mg/L;e:mg/L＋維拉帕米.

Rholow及Rhohigh細(xì)胞的分選受檢細(xì)胞大小、形態(tài)、細(xì)胞質(zhì)均一性一致,無PI染色細(xì)胞,無雜細(xì)胞干擾。單純加入Rho123組有一低熒光拖尾,而維拉帕米拮抗組無此區(qū)域,即Rholow細(xì)胞,占總數(shù)的%(圖2),其余為Rhohigh細(xì)胞。

圖2Rholow及Rhohigh細(xì)胞分選的FCM分析

Rholow及Rhohigh亞群的AFP免疫細(xì)胞化學(xué)比較2組細(xì)胞內(nèi)均有陽性表達(dá),陽性反應(yīng)為顯示位于細(xì)胞質(zhì)的棕黃色顆粒,共計(jì)數(shù)Rholow的肝癌細(xì)胞37個(gè),(-)為3個(gè),(+)為5個(gè),(++)為21個(gè),(+++)為9個(gè);Rhohigh的肝癌細(xì)胞29個(gè),(-)為5個(gè),(+)為16個(gè),(++)為6個(gè),(+++)為2個(gè),比較有學(xué)意義。

3討論

原發(fā)性肝細(xì)胞癌是我國(guó)常見惡性腫瘤之一,死亡率居世界之首,因此,對(duì)肝癌的防治是重點(diǎn)。癌發(fā)病機(jī)制的研究表明,肝臟中具有肝祖細(xì)胞特征的卵圓細(xì)胞參與了肝癌的發(fā)生;肝癌的異質(zhì)性表明,并不是每個(gè)肝癌細(xì)胞都具有行成腫瘤的能力,肝癌細(xì)胞之間在耐藥性上也有巨大的差異,這提示肝癌組織中可能存在有具有表型和功能特殊的肝癌細(xì)胞,分離和鑒定這群細(xì)胞是否具有干細(xì)胞特征對(duì)闡明肝癌發(fā)病機(jī)制、揭示肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制具有重要的意義,并為治療肝癌提供一個(gè)新的策略。

造血干/祖細(xì)胞具有將熒光染料Hoechst33342或Rho123泵出細(xì)胞外的特性,利用這一特性并結(jié)合FCM可對(duì)其進(jìn)行分離純化。Rho123/FCM的基本原理是利用了干細(xì)胞對(duì)染料具有排斥性這一特異性功能標(biāo)志,干細(xì)胞能通過細(xì)胞表面的P糖蛋白將進(jìn)入胞內(nèi)的Rho123主動(dòng)外泵至胞外,表現(xiàn)為低熒光的特征,可分選為Rholow和Rhohigh2個(gè)亞群[3,4]。而且多藥抵抗的現(xiàn)象一般伴隨P糖蛋白的過度表達(dá)。Lo等用Rho123/FCM成功富集了大鼠精原細(xì)胞,認(rèn)為Rho123/FCM相對(duì)Hoechst/FCM在分離精原細(xì)胞上是有優(yōu)勢(shì)的。

本實(shí)驗(yàn)中將培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞根據(jù)對(duì)Rho123染料外排能力不同分選為Rholow和Rhohigh2個(gè)亞群。2個(gè)亞群在AFP表達(dá)上存在明顯差異。AFP屬胚胎類抗原,作為1種胚胎時(shí)期或病理狀態(tài)的基因表達(dá)產(chǎn)物,它伴隨著胚胎發(fā)育和細(xì)胞分裂旺盛的過程。AFP是胚胎時(shí)期肝臟細(xì)胞合成的一種蛋白質(zhì),出生后基本不再合成。上,AFP已經(jīng)被作為常規(guī)診斷肝細(xì)胞肝癌的標(biāo)志物之一。此外,它還被作為術(shù)后或治療后預(yù)測(cè)預(yù)后的標(biāo)志物之一。據(jù)Oyunsuren等研究,在術(shù)后骨髓中AFPmRNA檢測(cè)陰性的患者中,第1年和第3年的存活率分別為%和%;而陽性的患者,存活率分別為%和%。

肝癌細(xì)胞分化程度越低,合成的AFP越多,AFP表達(dá)水平從一定程度上可判斷肝癌細(xì)胞的分化程度。AFP表達(dá)在2個(gè)亞群中有明顯差異,且強(qiáng)陽性主要分布在Rholow亞群中,提示Rholow亞群是具有更原始表型的細(xì)胞亞群,我們同時(shí)對(duì)此MHCC97細(xì)胞系用Hoechst33342染色后進(jìn)行分選,SP細(xì)胞所占的比例為%,與Rho123分選比例類似,還應(yīng)結(jié)合其他肝干細(xì)胞表面標(biāo)志如CK7、CK19或是原代細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

牟靜嵐,時(shí)永全.干細(xì)胞移植與消化系統(tǒng)疾病治療[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2006,22(4):550-552.

高飛,趙君,竇科峰,等.埃茲蛋白在肝細(xì)胞癌及其轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)及意義[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2006,22(2):227-229.

ChibaT,KitaK,ZhengYW,etal.Sidepopulationfromhepatocellularcarcinomacellsharborscancerstemcelllikeproperties[J].Hepatol,2006,44(1):240-251.

YulinWang,DaChengHao,WilfredD,etal.AkineticstudyofRodamine123pumpingbyPglycoprotn[J].BiochimBiophysActa,2006,1758(10):1671-1676.

LoKC,BrughVM3rd,ParkerM,etal.IsolationandenrichmentofmurinespermatogonialstemcellsusingRodamine123mitochondrialdye[J].BiolReprod,2005,72(3):767-771.

OyunsurenT,SanduijavR,DavaadorjD,etal.HepatocellularcarcinomaanditsearlydetectionbyAFPtestinginmongolia[J].AsianPacJCancerPrev,2006,7:460-462.

KamiyamaT,TakahashiM,NakagawaT,etal.AFPmRNAdetectedinbonemarrowbyrealtimequantitativeRTPCRanalysispredictssurvivalandrecurrenceaftercurativehepatectomyforhepatocellularcarcinoma[J].AnnSur