連錢草提取物抗炎作用機制研究

連錢草提取物抗炎作用機制研究

連草是嘴唇科植物的活血丹glecodapr（nakai）kuber。具有利濕通淋、清熱解毒、散淤消腫的功能。在民間被廣泛應用于治療尿路感染、感冒、跌打損傷、風濕性關節(jié)炎、腹瀉等。筆者在本實驗中對連錢草的抗炎作用作了初步研究,重點從炎癥遞質方面對其進行藥理實驗?，F(xiàn)將結果報道如下。1藥物、試劑和實驗動物1.1材料連錢草(自行采集于武漢大學珞珈山,經(jīng)湖北中醫(yī)學院中藥鑒定教研室陳家春教授鑒定)。連錢草水提物的制備:取適量連錢草干品,加純化水浸泡30min后,加熱煮沸,開始用強火,沸騰后改用文火煮沸30min,攪拌,趁熱過濾,藥渣再加純化水同法煮沸30min后過濾,合并濾液,水浴濃縮至100%(含生藥1g·mL-1)備用。連錢草醇提物的制備:取連錢草干品適量,加95%乙醇于圓底燒瓶中,浸泡6h后水浴加熱回流1h,趁熱過濾,藥渣再用75%乙醇加熱回流1h,過濾,合并濾液,減壓回收乙醇濃縮至100%(含生藥1g·mL-1)備用。阿司匹林(湖北制藥廠生產(chǎn),臨用前用1%CMC-Na配成混懸液備用);蛋清(市場上購買的新鮮雞蛋,取其蛋清);伊文思藍(上海化學試劑采購供應站經(jīng)銷,行知校辦廠分裝);角叉菜膠(購自Sigma公司);二甲苯、乙酸、乙醇、甲醇、正丁醇、正庚烷、鄰苯二甲醛(OPT)、NaIO4、氯化鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純或進口分裝。1.3實驗動物昆明種雌性未孕小鼠,體重18~22g;昆明種雄性小鼠,體重18~22g。所有動物均由湖北省醫(yī)學實驗動物中心提供。1.4儀器Bs200s電子天平(Sartorins公司),723紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司),LuminnescencespectrometerLS55熒光儀(PerkinElmerinstruments),TL04A離心機(北京大恒建?？瀑Q公司)。2方法和結果2.1醇提物對小鼠耳水腫的影響取雄性小鼠32只,體重18~22g。按體重隨機分為4組各8只,即0.9%氯化鈉溶液組、阿司匹林組、連錢草醇提物組和連錢草水提物組。每天灌胃給藥1次,連續(xù)3d,末次給藥后45min,以二甲苯0.02mL均勻涂于小鼠左耳廓兩側致炎,致炎1h后處死小鼠,沿耳廓基線剪下左右兩耳片分別稱重,以兩耳重量差作為腫脹度。結果見表1。連錢草水提物與醇提物對二甲苯致小鼠耳腫脹有顯著的抑制效果。與0.9%氯化鈉溶液組比較,*1P<0.052.2小鼠造林后的毛細管透氣性取雄性小鼠24只,體重18~22g。按體重隨機分為4組各6只,即0.9%氯化鈉溶液組、阿司匹林組、連錢草醇提物組和連錢草水提物組。每天灌胃給藥1次,連續(xù)3d,末次給藥1h后各鼠尾靜脈注射0.5%伊文思藍0.1mL·(10g)-1,隨后腹腔注射0.6%醋酸,每只0.2mL。20min后處死小鼠,各鼠用5mL0.9%氯化鈉溶液分次沖洗腹腔,收集腹腔洗出液,用722型分光光度計在590nm波長處測定吸光度值。結果見表2。連錢草水提物與醇提物對醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加有顯著的抑制效果。與0.9%氯化鈉溶液組比較,*1P<0.052.3角叉菜膠對小鼠水腫足中pge2含量的影響取雄性小鼠40只,體重18~22g。按體重隨機分為4組,即0.9%氯化鈉溶液組、阿司匹林組、連錢草醇提物組和連錢草水提物組。各組小鼠每天灌胃給藥1次,連續(xù)3d,末次給藥后45min,每只小鼠右后足墊皮下注射角叉菜膠0.9%氯化鈉溶液0.1mL,40min后從小鼠齊踝關節(jié)處剪下左后足,分別稱重,劃破皮膚后浸于裝有2.5mL0.9%氯化鈉溶液的試管中,不時振搖,2h后取出,將浸泡液3000r·min-1離心15min,取上清液0.3mL置于試管內,加入0.5mol·L-1氫氧化鉀(KOH)甲醇溶液1.0mL,50℃水浴20min異構化,加甲醇2.5mL,在278nm波長下進行比色,測定吸光度(A)值,用A值表示PGE2含量。結果見表3。連錢草醇提取物對角叉菜膠致小鼠腫脹足組織中炎癥遞質PGE2的釋放沒有抑制作用,而水提物組PGE2含量明顯升高。與0.9%氯化鈉溶液組比較,*1P<0.012.4醇提物對炎性足中組織胺含量的影響取雄性小鼠27只,體重18~22g。按體重隨機分為3組,即0.9%氯化鈉溶液組、連錢草醇提物組和連錢草水提物組。均每天灌胃給藥1次,連續(xù)3d,末次給藥后45min,每只小鼠右后足墊皮下注射10%新鮮蛋清0.9%氯化鈉溶液0.1mL,同時0.9%氯化鈉溶液[灌胃,4mL·(100g)-1]行水負荷。致炎后40min沿踝關節(jié)處剪下致炎足,稱重,劃破皮膚組織后浸泡于酸化正丁醇0.2mL中2.5h,再用超聲處理20min,去掉致炎足,浸液離心。取上清液1.5mL,加入正庚烷3mL和0.1mol·L-1鹽酸1.2mL,振搖5min,離心(3000r·min-1,5min),離心后取水相5mL,加入3mL三蒸水稀釋,再加0.4mol·L-1NaOH堿化,混勻,并迅速加入0.1%OPT溶液0.1mL,立即混勻,并在21~22℃反應10min,然后加入0.5mol·L-1鹽酸1mL酸化以終止縮合反應,在激發(fā)光波長360nm,發(fā)射光波長440nm下測定熒光強度,用熒光強度(int)表示炎性足組織中組織胺的相對含量(熒光法),比較給藥組和空白對照組組胺相對含量的差異。結果見表4。連錢草水提物對蛋清致小鼠腫脹足組織中炎癥遞質組胺的釋放有明顯抑制作用,但醇提物組織胺含量明顯升高。與0.9%氯化鈉溶液組比較,*1P<0.052.5連錢草水提物int-取雄性小鼠27只,體重18~22g。按體重隨機分為3組,即0.9%氯化鈉溶液組、連錢草醇提物組和連錢草水提物組各9只。每天灌胃給藥1次,連續(xù)3d,末次給藥后45min,每只小鼠右后足墊皮下注射10%新鮮蛋清0.9%氯化鈉溶液0.1mL,同時0.9%氯化鈉溶液[灌胃,4mL·(100g)-1]行水負荷。致炎后40min沿踝關節(jié)處剪下致炎足,稱重,劃破皮膚組織后浸泡于酸化正丁醇0.2mL中2.5h,再用超聲處理20min,去掉致炎足,浸液離心。取上清液1.5mL,加入正庚烷3mL和0.1mol·L-1鹽酸1.2mL,振搖5min,離心(3000r·min-1,5min),離心后取水相5mL,加入0.2mL5%半胱氨酸,再加0.004%的OPT鹽酸溶液6mL,混勻,并加入0.20mL0.02%的NaIO4溶液,沸水浴10min,在激發(fā)光波長365nm,發(fā)射光波長480nm下測定熒光強度,用熒光強度(int)表示炎性足組織中5-羥色胺的相對含量(熒光法),比較給藥組和空白對照組5-羥色胺相對含量的差異.結果見表5。連錢草水提物對蛋清致小鼠腫脹足組織中炎癥遞質5-羥色胺的釋放有明顯抑制作用(P<0.05),醇提物組有抑制5-羥色胺釋放的作用,但作用較水提物小。與0.9%氯化鈉溶液組比較,*1P<0.053炎癥遞質pge2、組織胺和5-羥色胺含量的測定炎癥是機體活組織對各種損傷因子所發(fā)生的以防御為主的反應,連錢草提取物對二甲苯致小鼠耳廓腫脹和小鼠腹腔毛細血管通透性增加等炎癥模型具有較強的抑制作用,表明連錢草提取物具有較強的抗炎作用。而PGE2、組織胺和5-羥色胺均為參與炎癥反應的主要炎癥遞質,在炎癥反應中起重要作用。筆者使用