三葉青提取物抗炎鎮(zhèn)痛及熱板法的研究

三葉青提取物抗炎鎮(zhèn)痛及熱板法的研究

三葉青是葡萄科植物的黃葉崖藤（gilg）干燥的分段根，分布在我國(guó)浙江、江西、福建、臺(tái)灣、湖北、廣東、四川、貴州、云南等省區(qū)。具有清熱解毒、散粘液、循環(huán)止痛的功效，臨床治療高燒、腹痛、肺炎、哮喘、肝炎等疾病，但未發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代藥理治療。本實(shí)驗(yàn)對(duì)三葉青提取物在抗炎、鎮(zhèn)痛及解熱等方面進(jìn)行了藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究,為其臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料和方法1材料表面1.1制備含生藥產(chǎn)品三葉青干品,購(gòu)于浙江省中醫(yī)院中藥房,經(jīng)浙江中醫(yī)學(xué)院資源鑒定教研室鑒定。三葉青提取物(ExtractofRadixTetrastigmae,ERT)的制備:將1000g藥材常規(guī)加工粉碎后過20目篩,用水回流提取2次,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至相當(dāng)于含生藥0.16g·mL-1,置冰箱備用。伊文思蘭(進(jìn)口分裝,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)F20040213);二甲苯(分析純,江蘇三木集團(tuán)化工廠產(chǎn)品,批號(hào)20000410);醋酸(分析純,浙江杭州化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20040607);阿司匹林腸溶片(南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司,批號(hào):040622);羅通定片(廣東省博羅先峰藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號(hào):030601);干酵母(浙江省富陽(yáng)市杭富生物制品廠,批號(hào):050121);2,4-二硝基苯酚(上海試劑三廠,批號(hào)950920)。1.2動(dòng)物昆明種小鼠,18~22g,雌雄兼用;SD大鼠180~200g,雌雄兼用。均由浙江中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.3鼠部水質(zhì)及體溫w721型分光光度計(jì)(四川分析儀器廠產(chǎn)品);GJ-8402型熱板測(cè)痛儀[電壓220V,功率150W,溫度(55±0.2)℃,浙江寧海白石電子醫(yī)藥儀器廠產(chǎn)品];RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);半導(dǎo)體體溫表(上海醫(yī)用儀表廠);TG-328型電子分析天平(上海天平儀器廠);排水法測(cè)定鼠爪體積裝置(自制);TDZ5-WS低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。2方法2.1抗炎作用2.1.1小鼠分組及給藥方案取小鼠50只,雌雄各半,隨機(jī)均分5組。空白對(duì)照組給同劑量的生理氯化鈉溶液(NS),ERT高中低劑量3組(4.8,2.4,1.2g·kg-1)、陽(yáng)性藥組(阿司匹林100mg·kg-1)。各組均ig給藥,qd,連續(xù)4d。于末次給藥后1h,每組每只小鼠依次自尾靜脈注射5%伊文思蘭0.1mL·10g-1,同時(shí)腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2mL。30min后斷頭處死小鼠,剖開腹腔,每次用5mL生理氯化鈉溶液沖洗腹腔,共3次,用吸管吸取腹腔洗出液,離心5min(3000r·min-1),取上清液,721型分光光度計(jì)590nm測(cè)吸收度。2.1.2ld503d取小鼠50只,雌雄各半,隨機(jī)均分5組,分組情況同2.1.1。各組均ig給藥,qd,連續(xù)4d。于末次給藥后1h,各組小鼠右耳廓兩面均勻涂抹二甲苯(每只0.05mL),4h后脫頸椎處死小鼠,沿耳廓邊緣剪下左、右兩耳,用8mm打孔器在兩耳相同部位取下耳片,電子分析天平稱重,用右耳片重量減去左耳片重量,即得到腫脹凈值,并計(jì)算耳腫抑制率。2.1.3大鼠sc10%蛋清取雌雄大鼠50只,隨機(jī)均分5組,分組情況同2.1.1。各組均ig給藥,qd,連續(xù)4d。于實(shí)驗(yàn)當(dāng)日先用排水法測(cè)定鼠爪體積裝置測(cè)量每只大鼠右后足跖正常體積,給藥后60min,予每只大鼠右后足跖(右后足掌心向踝關(guān)節(jié)方向)sc10%蛋清0.1mL。分別測(cè)量給藥后1,2,3及4h大鼠右后足跖體積,用致炎后體積減去正常體積所得差值,即為各時(shí)間段足跖腫脹凈值。2.2使用植物鎮(zhèn)痛2.2.1陽(yáng)性組和陽(yáng)性藥組10.2.4取雌雄各半小鼠50只,隨機(jī)均分5組。分別為空白對(duì)照組(NS)、ERT高中低劑量3組(4.8,2.4,1.2g·kg-1)、陽(yáng)性藥組(羅通定50mg·kg-1)。各組均ig給藥,qd,連續(xù)3d。于末次給藥后1h,各組小鼠均ip0.6%醋酸溶液0.2mL,記錄自注射醋酸致痛后每只小鼠在20min內(nèi)出現(xiàn)的扭體反應(yīng)次數(shù),結(jié)果作組間比較,并計(jì)算鎮(zhèn)痛率。2.2.2給藥前痛閾值的測(cè)定取雌性小鼠若干,于正式實(shí)驗(yàn)前先逐只用熱板測(cè)痛儀進(jìn)行篩選。篩選時(shí)每次取小鼠1只,記錄自放入測(cè)痛儀中至出現(xiàn)舔后足所需時(shí)間(s),以此作為該小鼠給藥前痛閾值,凡是5s內(nèi)出現(xiàn)舔后足或30s內(nèi)不出現(xiàn)舔后足者棄之不用。將預(yù)選合格的小鼠作正式實(shí)驗(yàn),每組10只,共5組,分組情況同2.2.1。各組均ig給藥,于給藥后每隔30min測(cè)定各組小鼠痛閾值,連續(xù)測(cè)3次。超過60s者則按60s計(jì)算。2.3set的解熱作用2.3.1大鼠前近代血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)大鼠前因子檢測(cè)取雌雄大鼠若干,預(yù)測(cè)體溫3d,bid。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日測(cè)定大鼠基礎(chǔ)體溫,篩選體溫波動(dòng)小者為實(shí)驗(yàn)用大鼠,用20%酵母混懸10mg·kg-1注入大鼠背部皮下,6h后測(cè)量肛溫,凡直腸溫度上升不到0.8℃的大鼠剔除不用,取合格大鼠50只分為5組,空白對(duì)照組(NS)、ERT3組(4.8,2.4,1.2g·kg-1)、陽(yáng)性藥組(阿司匹林100mg·kg-1),均ig給藥,于給藥后每隔60min測(cè)定各組大鼠肛溫,連續(xù)測(cè)3次。2.3.2實(shí)驗(yàn)用大鼠分組取雌雄大鼠50只,預(yù)測(cè)體溫3d,bid。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日測(cè)定大鼠基礎(chǔ)體溫,篩選體溫波動(dòng)小者為實(shí)驗(yàn)用大鼠。隨機(jī)均分5組,分組情況同2.3.1,均ig給藥。灌胃給藥后60min,于背部皮下注射2,4-二硝基苯酚10mL·kg-1(160mg·kg-1)致熱,每隔30min測(cè)量大鼠體溫1次,連續(xù)測(cè)定3h。3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理鎮(zhèn)痛、抗炎及解熱各實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均采用ˉx±s表示。結(jié)果統(tǒng)計(jì)均采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。結(jié)果1影響小鼠和大鼠的急性炎癥反應(yīng)1.1細(xì)血管透皮張力結(jié)果表明,ERT高、中劑量組對(duì)小鼠毛細(xì)血管通透性有顯著的抑制作用,見表1。與對(duì)照組比較,a:P<0.05,b:P<0.01,c:P<0.001(下同)1.2耳廓急性炎癥性水腫結(jié)果表明,ERT各劑量組可明顯抑制二甲苯所致小鼠耳廓急性炎癥性水腫,與空白對(duì)照組比較差異顯著。提示ERT對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹有明顯抑制作用,見表2。1.3ert的抑制作用結(jié)果表明,在蛋清致大鼠足跖致炎4h的不同時(shí)間段內(nèi),ERT各劑量組均有抑制腫脹作用,與空白對(duì)照組比較差異顯著,提示ERT對(duì)蛋清致大鼠足腫脹有顯著抑制作用,見表3。2影響小鼠疼痛反應(yīng)的因素2.1致小鼠扭體次數(shù)與空白對(duì)照對(duì)結(jié)果表明,ERT高、中劑量組對(duì)醋酸所致小鼠扭體次數(shù)與空白對(duì)照組比較明顯減少,具有顯著差異。提示藥物對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)有明顯抑制作用,見表4。2.2影響熱板反應(yīng)的因素結(jié)果表明,ERT各劑量組均能提高熱致痛小鼠的痛閾率,提示其可抵抗熱致痛對(duì)小鼠的影響,并使其痛感潛伏期明顯延長(zhǎng),見表5。3解熱作用3.1兩組大鼠體溫下降持續(xù)時(shí)間比較結(jié)果表明,ERT高、中劑量組能使酵母致熱的大鼠體溫下降持續(xù)時(shí)間達(dá)180min;而低劑量組只有在180min時(shí)才體現(xiàn)降溫作用。提示ERT對(duì)干酵母所致大鼠高熱有解熱作用,見表6。3.2兩組體溫下降ERT高、中劑量組能使2,4-二硝基苯酚致熱的大鼠體溫下降,持續(xù)時(shí)間達(dá)180min之久;而低劑量組于150min后才體現(xiàn)明顯的降溫作用。提示ERT對(duì)2,4-二硝基苯酚所致大鼠高熱有解熱作用,見表7。熱板法小鼠炎癥因子各組ERT能明顯抑制醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性,其中以4.8g·kg-1作用最明顯(P<0.001);對(duì)二甲苯所致小鼠耳殼腫脹有明顯的抑制作用,與阿司匹林作用相似(P<0.001);ERT還可抑制大鼠蛋清性足腫脹,尤其在2.4g·kg-1作用顯著(P<0.001),優(yōu)于阿司匹林。結(jié)果提示ERT對(duì)急性炎癥有明顯的抑制作用。ERT各組對(duì)醋酸所致小鼠扭體次數(shù)較空白對(duì)照組明顯減少,其中2.4g·kg-1作用最明顯(P<0.001);同時(shí)ERT各組還能顯著提高熱板法小鼠痛閾值,提示ERT有明顯的鎮(zhèn)痛作用。ERT各組能顯著降低干酵母