煙草中擬南芥fx病毒瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建

煙草中擬南芥fx病毒瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建

植物開花是一個(gè)復(fù)雜的過程，受到外部環(huán)境因素和內(nèi)部環(huán)境因素的影響。擬南芥的開花受光周期、自主途徑、春化途徑和赤霉素途徑控制,光周期途徑信號(hào)經(jīng)CO(CONSTANCE)傳遞給FT(FloweringLocusT),春化途徑和自主途徑信號(hào)經(jīng)FLC(FloweringLocusC)傳遞給FT,FT基因的表達(dá)誘導(dǎo)花分生組織特異基因AP1(APETALA1)的表達(dá),從而誘導(dǎo)開花?？梢?FT基因是控制植物開花信號(hào)的匯集點(diǎn)。從對(duì)擬南芥FT基因的研究來看,FT編碼的蛋白可能是植物“開花素”的重要組成部分。FT基因在誘導(dǎo)植物早花的基因工程研究中應(yīng)用也最為廣泛和有效。FT基因編碼的蛋白質(zhì)屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(Phosphatidylethanolamine-bindingprotein,PEBP)家族,不同作物的FT基因高度保守。通過異位表達(dá)擬南芥FT基因,能夠誘導(dǎo)番茄、矮牽牛、瓜類蔬菜等提前開花。利用FT基因誘導(dǎo)早花在煙草中也已有報(bào)道,Ramsey等將擬南芥FT基因?qū)氚桌邿烼N90中組成型表達(dá),轉(zhuǎn)基因植株播種后40天左右開花,而正常的非轉(zhuǎn)基因植株要145天左右開花。Ramsey提出將轉(zhuǎn)FT基因應(yīng)用于煙草回交育種,與常規(guī)回交選育相比,育成新品種的時(shí)間可以縮短將近一半,利用病毒表達(dá)載體使FT基因在煙草中瞬時(shí)表達(dá),能夠誘導(dǎo)短日照馬里蘭煙在長日照條件下開花。我國煙草育種工作雖然取得了明顯的成績,但目前生產(chǎn)上的主栽品種比較單一,急需加大煙草品種選育的力度和進(jìn)度,而煙草生育期比較長,是限制煙草育種進(jìn)程的一個(gè)主要因素。PVX表達(dá)系統(tǒng)能夠快速表達(dá)外源基因,而且不涉及轉(zhuǎn)基因。本研究利用PVX瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)使擬南芥FT基因在烤煙、香料煙、白肋煙中瞬時(shí)表達(dá),建立誘導(dǎo)煙草早花的PVX-FT系統(tǒng),以期為加快煙草育種進(jìn)程提供技術(shù)支撐。1材料和方法1.1基因x-nh-t4基因烤煙品種K326,云煙87,紅花大金元;白肋煙品種TN90;香料煙TEVB(轉(zhuǎn)基因Xanthi,將TEV的HC-Pro基因?qū)隭anthi,使PVX病毒更容易侵染)。限制性內(nèi)切酶購于NEB,T4DNA連接酶購于大連寶生物。根癌農(nóng)桿菌GV3101,PVX-FT病毒表達(dá)載體由北卡州里大學(xué)RalphDewey教授惠贈(zèng)。1.2菌株的活化和接種將構(gòu)建的載體pCAM:pGR106-FT和空載體pCAM:pGR106質(zhì)粒DNA通過凍融法分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌種GV3101。選取4片真葉左右煙苗的底部2片真葉滲濾法分別接種,利用3mL注射器吸取滲濾液,注射器對(duì)著葉片背面輕輕擠壓,直到整個(gè)葉面濕潤。具體步驟參考VanderHoorn等。1.3夜12h溫度煙苗種植于光照培養(yǎng)室,光照12h白天,黑夜12h。溫度設(shè)定為白天26℃,黑夜18℃。PVX癥狀出現(xiàn)時(shí)間、現(xiàn)蕾和開花時(shí)間分別以50%試驗(yàn)苗出現(xiàn)PVX癥狀、現(xiàn)蕾和開花的時(shí)間表示。1.4rna提取及rt-pcr合成取滲濾后不同時(shí)間段有PVX病毒癥狀的煙株葉片,用Trizol(Invitrogen)提取RNA,SuperScriptIIRT(Invitogen)合成cDNA。對(duì)FT基因的表達(dá)進(jìn)行半定量PCR(RT-PCR)分析。2結(jié)果2.1pvx病毒檢出及形成時(shí)期PVX-FT系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)供試烤煙、香料煙、白肋煙品種早花。PVX病毒癥狀在接菌后7~14天出現(xiàn),質(zhì)粒pCAM:pGR106對(duì)照要比pCAM:pGR106-FT處理提前2~3天出現(xiàn)PVX癥狀。接菌后23~35天pCAM:pGR106-FT處理處于現(xiàn)蕾期,接菌后39~50天pCAM:pGR106-FT處理開花(表1)。質(zhì)粒對(duì)照和buffer對(duì)照在pCAM:pGR106-FT處理開花時(shí)仍然處于營養(yǎng)生長階段(圖1)。2.2rt-pcr檢測滲濾煙株中tevb的表達(dá)為了研究滲濾后FT基因在煙株中的表達(dá)情況,我們提取了接菌后4天,8天,12天,現(xiàn)蕾階段,開花階段葉片的RNA,進(jìn)行FT基因的RT-PCR。在試驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)同一批滲濾煙株(TEVB),少量植株接菌后表現(xiàn)病毒癥狀,但不早花。提取這些植株的兩個(gè)時(shí)間段(與表現(xiàn)早花植株現(xiàn)蕾和開花同時(shí)間)葉片RNA,進(jìn)行RT-PCR分析。發(fā)現(xiàn)不早花的植株,FT基因不表達(dá)。早花植株在接菌后4天到開花期都能檢測到FT基因的表達(dá)(圖2)。3pvx-ft基因在煙草早花中的應(yīng)用馬鈴薯X病毒作為瞬時(shí)表達(dá)載體具有宿主范圍廣泛、轉(zhuǎn)化方法簡單、可快速得到高拷貝的外源基因、目的基因不需穩(wěn)定整合到宿主基因組中就可以系統(tǒng)侵染植株等優(yōu)點(diǎn),而且其不能通過昆蟲介體傳播,因而成為理想的植物病毒表達(dá)載體之一。1992年Chapman等成功構(gòu)建PVX表達(dá)載體,目前,已被廣泛應(yīng)用于研究病毒的侵染、移動(dòng)、病毒蛋白的功能及生產(chǎn)外源蛋白等方面。但是,PVX表達(dá)載體也有一些缺陷。如其對(duì)外源基因大小有一定的限制,PVX載體對(duì)于超過2kb的基因很難表達(dá)或不表達(dá);PVX載體經(jīng)多代繁殖后外源基因容易丟失等。植物每個(gè)調(diào)控途徑有一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),涉及多個(gè)基因。由于FT基因參與了多個(gè)開花調(diào)控途徑,并且其位于開花通道下游,所以FT基因被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)植物早花研究。利用蘋果潛隱球形病毒(ALSV)在大豆中使擬南芥FT基因瞬時(shí)表達(dá),FT-ALSV能使短日照大豆在長日照條件下,在第四到第七節(jié)(侵染后40天左右)期開花,而對(duì)照要到20節(jié)以上才開花。不僅如此,FT基因還能誘導(dǎo)多年生的蘋果樹早花,利用ALSV載體使擬南芥FT基因在蘋果樹中瞬時(shí)表達(dá),在侵染后45到60天,蘋果樹就能開花,大大縮短了蘋果育種中每代需要的時(shí)間。Li等利用PVX載體在馬里蘭煙中瞬時(shí)表達(dá)FT,誘導(dǎo)短日照習(xí)性的馬里蘭煙在長日照條件下早花。本研究利用PVX病毒載體將擬南芥FT基因在不同類型煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),結(jié)果表明PVX-FT系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)烤煙、白肋煙和香料煙早花。可見PVX-FT系統(tǒng)可以誘導(dǎo)不同類型煙草早花。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)PVX-FT處理一批苗時(shí)會(huì)有個(gè)別煙株不表現(xiàn)早花的現(xiàn)象,這種煙株中檢測不到FT基因表達(dá),這種現(xiàn)象可能是由于PVX-FT載體在繁殖過程中FT基因丟失造成的。本研究構(gòu)建的PVX-FT系統(tǒng),可明顯縮短煙草每世代所需的時(shí)間,應(yīng)用于煙草常規(guī)育種后將大大縮短育成新品種所需的時(shí)間。由于PVX-FT侵染煙草后會(huì)植株會(huì)表現(xiàn)PVX癥狀,所以該技術(shù)適用于