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文檔簡介

熒光定量PCR

北京康為世紀生物科技有限公司細胞RNA提取樣品：293T細胞試劑：超純RNA提取試劑盒、氯仿、70%乙醇方法：柱式原理：細胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放。釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH和鹽濃度下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離。

細胞懸液離心，倒掉上清，加入1ml

RLT；

反復吹打，使樣本充分裂解；室溫放置5min，使核酸蛋白復合物完全分離1.裂解：2.抽提：加入200ul氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置2min；4℃12,000rpm離心10分鐘，此時樣品分為三層；

上層無色水相，

中間白色蛋白質相，

下層紅色有機相，

RNA在上層水相中細胞RNA提取3.過柱子：

吸取上層水相，至新的RNase-Free管中（注：不要吸到中層）加入等體積70%的乙醇，顛倒混勻；將溶液全部加入到已裝入收集管（CollectionTube2ml)的吸附柱（SpinColumnRM）中。若一次(700ul)不能加完溶液，可分多次入；12,000rpm離心20s，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中；4.

洗滌：

向吸附柱加入700μl

Buffer

RW1，12,000rpm離心20s，倒掉收集管中的廢液，

將吸附柱重新放回收集管中；

向吸附柱中加入500μlBufferRW2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），

12,000rpm離心20s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；重復步驟8；12,000rpm離心2min，棄廢液，吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干；細胞RNA提取5.

洗滌：

將吸附柱置于一個新的無RNase離心管（CollectionTube1.5ml）中向吸附柱的

中間部位加入30-50μlRNase-FreeWater，室溫放置1min，12,000rpm離心1min，

收集RNA溶液，進行后續(xù)試驗或-70℃保存RNA，防止降解。注意：1）RNase-FreeWate體積不應小于30μl，體積過小影響回收率。

2）若提高RNA的產量，可用30-50μl新的RNase-FreeWater重復步驟5。

3）若提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復步驟5。6.RNA檢測：用ddH2O，對儀器進行調零；取1ul的RNA溶液進行測定；測定樣品純度和濃度。純度：OD260/OD280=1.9-2.1<1.8蛋白質或

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