毛果楊nlp基因家族的生物信息學(xué)分析

毛果楊nlp基因家族的生物信息學(xué)分析

植物需要在整個(gè)生命周期中產(chǎn)生大量的氮素營養(yǎng)。硝酸鹽是土壤中存在的一種主要氮素形態(tài),在植物生長以及發(fā)育過程中發(fā)揮重要的生理以及營養(yǎng)作用［1］。植物中一些氮素吸收以及同化相關(guān)基因能夠受外界氮素濃度的影響在表達(dá)上發(fā)生變化,如銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(AMT),硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(NRT),硝酸還原酶基因(NR)以及亞硝酸還原酶(NIR)［2～5］等。一些具有感知硝酸鹽信號能力的基因與轉(zhuǎn)錄因子在硝酸鹽吸收以及同化的過程中起著重要的調(diào)控作用［6］。NIN(noduleinception)基因在百脈根中被首次發(fā)現(xiàn),并確豆科植物根瘤形成依賴于該基因的存在,后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn),在非豆科植物中也存在該類基因,推斷其可能參與到硝酸鹽的同化過程之中,并命名為NLP(NINlikeprotein)基因［8～9］。NLP基因家族成員都具有RWP-RK和PB1兩個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域,RWP-RK結(jié)構(gòu)域具有與DNA結(jié)合的功能,PB1結(jié)構(gòu)域具有與其他含有該結(jié)構(gòu)域的基因形成二聚體的功能［8］。2008年在擬南芥中發(fā)現(xiàn)NLP7是具有感應(yīng)硝酸鹽信號的轉(zhuǎn)錄因子,在擬南芥中敲除NLP7后,擬南芥突變體nlp7與正常野生型相比顯示出明顯的缺氮狀態(tài)與抗旱能力,并且NRT2;1/2;2與NIR1/2基因表達(dá)量均顯著性下調(diào);當(dāng)在nlp7突變體中恢復(fù)NLP7表達(dá)之后,不僅恢復(fù)了這些基因的表達(dá)而且還恢復(fù)了突變體對硝酸鹽的吸收,由此證明NLP7基因具有參與感受硝酸鹽信號以及調(diào)節(jié)硝酸鹽吸收的功能［7］。2013年陸續(xù)兩篇文章對NLP基因家族成員的作用機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)的報(bào)道。Konishi等證明NLP基因的蛋白質(zhì)N端能夠感受硝酸鹽信號,而后特異性的結(jié)合啟動子中具有NRE(nitrate-responsivecis-element)原件的基因,從而調(diào)節(jié)植物對硝酸鹽的吸收以及同化［11］。Marchive等對NLP7基因能影響的所有的代謝通路以及在硝酸鹽早期吸收以及利用上進(jìn)行了細(xì)致的研究,結(jié)果表明NLP7基因不僅參與調(diào)控N代謝循環(huán),還對C代謝循環(huán)以及激素代謝有一定的調(diào)控功能［10］。楊屬(Populus)植物具有易繁殖,生長迅速等特點(diǎn),并且諸多樹種已經(jīng)建立了完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系,成為木本植物研究的模式生物。自2006年毛果楊(Populustrichocarpa)基因組數(shù)據(jù)公布以來,其功能基因組學(xué)研究已逐步深入,僅就氮素吸收方面,毛果楊的AMT基因家族與NRT基因家族已經(jīng)被詳細(xì)的分析［12～13］。本研究,以生物信息學(xué)方式對毛果楊的NLP基因家族成員進(jìn)行確定,直系同源與旁系同源進(jìn)化分析,基因結(jié)構(gòu)分析,保守結(jié)構(gòu)域分析,以及全組織表達(dá)模式分析,為進(jìn)一步研究楊樹NLP基因功能以及在對硝酸鹽吸收與同化過程中的調(diào)控模式提供基礎(chǔ)。1材料和方法1.1nlp基因家族成員的確定［14～15］。將候選基因分別在SMART(SimpleModularArchitectureResearchTool)(http://smart.embl-heidelberg.de/)數(shù)據(jù)庫分析驗(yàn)證RWP-RK與PB1基序的存在,將具有RWP-RK與PB1結(jié)構(gòu)域的基因后確定為楊樹NLP基因家族成員。1.2楊樹nlp基因家族成員的蛋白質(zhì)序列理化性質(zhì)分析與細(xì)胞定位預(yù)測1.3旁系同源進(jìn)化樹的構(gòu)建［16］。將毛果楊NLP基因家族成員蛋白質(zhì)序列通過ClustalW2軟件進(jìn)行多重序列比對,利用軟件MEGA5采用鄰近法(N-J)法構(gòu)建旁系同源進(jìn)化樹,bootstrap值設(shè)置成1000次。1.4鉻定位分析［17］。1.5基因結(jié)構(gòu)分析1.6楊潔篪遺傳因子的表現(xiàn)模式分析［18～19］。2結(jié)果與分析2.1rwp-rk的低親水性基因家族pb1經(jīng)分析,最終確定了14個(gè)毛果楊NLP基因家族成員(表1)。這些毛果楊NLP基因家族成員均含有RWP-RK與PB1保守結(jié)構(gòu)域。他們的蛋白質(zhì)長度不等,最短的為519aa,最長的為1000aa。整個(gè)基因家族都具有低親水性的特點(diǎn),GARVY值從-0.38~-0.646不等。等電點(diǎn)(pI)值最高達(dá)到7.86,最低的為5.25。所有家族成員均為細(xì)胞核定位。2.2毛果楊nlp基因家族成員構(gòu)成為確定毛果楊NLP基因家族的本質(zhì)特征,我們分別進(jìn)行了直系同源以及旁系同源的進(jìn)化分析。通過直系同源分析發(fā)現(xiàn),NLP基因家族共分成3個(gè)明顯的亞枝,分別將各亞枝命名為NLP1cluster,NLP2cluster和NLP3cluster(圖1)。在毛果楊中,NLP3cluster的成員最多,達(dá)19個(gè),而NLP1cluster和NLP2cluster分別有3個(gè)和2個(gè)成員。與擬南芥相比毛果楊NLP基因家族成員的總數(shù)量是擬南芥的1.56倍,這個(gè)滿足Tuskan等提出的毛果楊基因家族成員的個(gè)數(shù)是擬南芥的相應(yīng)同源基因數(shù)的1.4~1.6倍的推斷［17］。通過旁系同源進(jìn)化分析我們共在毛果楊中找到6對同源基因?qū)?每一個(gè)基因同源對的基因相互間同源性極高,這說明毛果楊NLP基因家族成員在楊樹進(jìn)化過程中經(jīng)歷了嚴(yán)格的進(jìn)化選擇(圖2A)。2.3毛果楊基因組中的染色體同源基因?yàn)榱嗣鞔_毛果楊NLP基因家族成員間的進(jìn)化關(guān)系,我們對所有成員進(jìn)行了染色體定位分析。在14個(gè)成員中只有PtrNLP13不能定位在染色體上而是定位在scaffold片段外,其余的基因都分別定位在1、2、3、4、5、7、9、16和17號染色體中的染色體同源區(qū)域之內(nèi)(圖3)。楊樹基因組在進(jìn)化史上經(jīng)歷了兩次染色體擴(kuò)增事件,第一次來自擬南芥染色體加倍,第二次來自楊柳科染色體加倍［17］。在毛果楊基因組中存在著大量的染色體同源區(qū)域,在可以定位在毛果楊染色體中的NLP基因家族成員中除PtrNLP9丟失了同源基因外,其余的基因都能在相應(yīng)的染色體同源區(qū)域中找到相應(yīng)的同源基因?；蚣易宄蓡T的擴(kuò)增來源于基因組的同源交換,染色體串聯(lián)復(fù)制等其他基因組進(jìn)化的大事件。在毛果楊NLP基因家族成員的擴(kuò)增中,主要是由于染色體的同源復(fù)制引起的。我們的分析發(fā)現(xiàn)4對基因(PtrNLP1/2,PtrNLP8/9,PtrNLP10/11和PtrNLP12/14)是由染色體片段復(fù)制事件引起的。而PtrNLP3/4/6/7四個(gè)基因有可能來源于同一個(gè)祖先基因,在毛果楊染色體進(jìn)化史經(jīng)歷了染色體片段復(fù)制后,又經(jīng)歷了兩次串聯(lián)復(fù)制。該結(jié)果表明,毛果楊NLP基因家族成員的擴(kuò)增來源于染色體的片段復(fù)制以及串聯(lián)復(fù)制事件。2.4nlp3clnuser成員間的基因結(jié)構(gòu)為了進(jìn)一步的了解毛果楊NLP基因家族成員間的特征,我們分析了毛果楊NLP基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)(圖2B)。NLP1/2cluster成員均含有5個(gè)外顯子,并且基因結(jié)構(gòu)比較保守。但NLP3cluster成員含有2~7個(gè)外顯子,并且成員間基因結(jié)構(gòu)有所差異。通過外顯子比對分析發(fā)現(xiàn)這種差異是由于外顯子的丟失以及內(nèi)含子的插入或者缺失造成的。多重比對分析結(jié)果顯示,楊樹NLP成員間蛋白質(zhì)序列比較保守,均含有RWP-RK與PB1保守區(qū)域,另外還存在4個(gè)未知功能的保守基序。但PtrNLP1C端大面積缺失,不存在這四個(gè)未知功能的保守基序(圖4)。2.5表達(dá)模式分析3毛果楊nlp基因家族分析NLP基因家族成員是一類轉(zhuǎn)錄因子,廣泛存在于豆科植物以及非豆科植物當(dāng)中,它主要參與豆科植物根瘤的形成以及調(diào)控植物根部硝酸鹽的吸收［9］。擬南芥NLP基因家族成員的RWP-PK結(jié)構(gòu)域的N端側(cè)翼序列具有感受硝酸鹽信號的功能,在感受到硝酸鹽信號后,NLP7蛋白質(zhì)脫離翻譯后修飾狀態(tài)進(jìn)入活躍狀態(tài),特異性的識別并結(jié)合具有NRE原件的基因的啟動子上,從而對提高可受硝酸鹽誘導(dǎo)的基因進(jìn)行調(diào)控［10～11］。目前為止,植物中的NLP基因功能性研究較少,只有擬南芥NLP基因家族成員有較為詳細(xì)的功能性研究,而全基因組鑒定方面的報(bào)道更是少之又少。本文以毛果楊為模式植物,首次對林木類植物的NLP基因家族進(jìn)行分析。通過對最新毛果楊蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的搜索,我們共發(fā)現(xiàn)14個(gè)毛果楊NLP基因家族成員。毛果楊NLP基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域分布非常保守,都含有RWP-PK與PB1結(jié)構(gòu)域,與其他非豆科植物NLP基因一樣,毛果楊NLP基因在N端多出兩段保守序列,這為豆科植物NLP基因與非豆科植物NLP基因功能上的差異性提供了分子證據(jù)［8］。直系同源進(jìn)化分析結(jié)果表明,PtrNLP10/11與擬南芥AtNLP6/7被分配在同一個(gè)亞枝之中,并且PtrNLP11與AtNLP7具有相似的表達(dá)模式,因此我們推測PtrNLP11與AtNLP6/7具有相似的功能在楊樹根的硝酸鹽吸收以及同化過程中發(fā)揮重要的作用。芯片表達(dá)模式結(jié)果顯示