細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)用操作

細(xì)胞培養(yǎng)

cellcultivation

1665年植物學(xué)家羅伯特.琥克第一次引入“細(xì)胞”概念，1906年諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)授于關(guān)于細(xì)胞生物學(xué)研究、N.S結(jié)構(gòu)研究方面的工作Golgi與cajal。1907年開(kāi)始組織培養(yǎng)工作。1925年wilson提出解決生物學(xué)問(wèn)題的關(guān)鍵最終將在細(xì)胞中尋找到。隨著科學(xué)的發(fā)展及技術(shù)進(jìn)步，從事生物醫(yī)學(xué)研究的學(xué)者越來(lái)越迫切地認(rèn)為利用細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)解決實(shí)際工作中所遇到的問(wèn)題是非常必要的，它對(duì)任何生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)都是必不可少的。

細(xì)胞培養(yǎng)的概念：指從體內(nèi)取出組織后，分離的細(xì)胞在模擬體內(nèi)生理環(huán)境等特定的條件下進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使之生存、生長(zhǎng)，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。一細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)：（一）細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：1．研究的對(duì)象是活的細(xì)胞：可評(píng)定細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能、生化特征，它是其他方法無(wú)法取代的。2．研究的條件可人為控制：可控制pH、T、O2張力、CO2張力等物理?xiàng)l件，同時(shí)也可施加化學(xué)、生物等因素作為條件而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)、觀察。這些因素可嚴(yán)格控制。3．研究的樣本可以達(dá)到比較均一性、重復(fù)性好：如細(xì)胞株則可達(dá)到均一性，而且純化。4．研究的內(nèi)容可以便于觀察、檢測(cè)和記錄：倒置顯微鏡及光鏡可觀察細(xì)胞形態(tài)、電鏡可以觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；同位素標(biāo)記、放射免疫、免疫組化可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)合成、代謝、定位；流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞表面抗原（鑒定細(xì)胞性質(zhì)）、凋亡等；PCR檢測(cè)；自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)等等。5．研究的經(jīng)費(fèi)相對(duì)較經(jīng)濟(jì)。6．研究范圍比較廣泛：細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生化學(xué)、組織胚胎學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等。

可用于以下研究：①細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用：細(xì)胞間粘著、侵襲、接觸抑制等。②細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)胞外界之間作用：細(xì)胞對(duì)外界刺激（藥物、化學(xué)試劑、物理因素、生物因素等）反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物的改變。③細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)的活動(dòng)：能量代謝及蛋白質(zhì)合成變化。④胞質(zhì)與胞核之間的流動(dòng)：RNA自胞核至胞質(zhì)，胞質(zhì)激素受體復(fù)合物易位至核等。

（二）細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn)：與體內(nèi)條件存在差別，長(zhǎng)期體外培養(yǎng)可使細(xì)胞形態(tài)、功能都發(fā)生一定程度的改變。

二細(xì)胞培養(yǎng)條件：1．細(xì)胞培養(yǎng)所需設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)室（超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、CO2孵育箱、離心機(jī)、冰箱等）；清潔室（浸泡玻璃器皿的清潔液、浸泡塑料和橡皮制品的0.5％HCl和1％NaOH、蒸餾水、烤箱等）。2．無(wú)菌技術(shù)：工作環(huán)境的無(wú)菌處理（紫外線照射）、細(xì)胞培養(yǎng)所用器材的無(wú)菌處理（高壓消毒或紫外線照射）、實(shí)驗(yàn)者的無(wú)菌操作技術(shù)等。防止微生物污染（細(xì)菌、霉菌、黑膠蟲(chóng)）。

3．培養(yǎng)液：基本的細(xì)胞培養(yǎng)液由必需氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖、血清（內(nèi)含血漿蛋白、肽類、脂肪、生長(zhǎng)因子、激素、貼壁因子等）等組成。一般常用RPMI1640、DMEM、F12、M199等粉劑，用三蒸水配成液體，內(nèi)加入NaHCO3及二抗10萬(wàn)/L，調(diào)整pH7.2-7.4，除菌（孔經(jīng)0.22μm），分裝保存、備用；應(yīng)用時(shí)需加入新生（或胎）牛血清。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)還需配制除菌的PBS液、Hank’s液、胰酶等備用。三．培養(yǎng)中的細(xì)胞系生長(zhǎng)方式：1．懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞：細(xì)胞不貼壁，常呈圓形。培養(yǎng)細(xì)胞離心沉淀，再懸于新培養(yǎng)液中計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104-5×105個(gè)細(xì)胞/ml。如白血病細(xì)胞。2．貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞：細(xì)胞貼壁，常呈多角形或梭形。傾去培養(yǎng)液、用0.25％胰蛋白酶或0.1％胰蛋白酶0.02％EDTA消化、終止消化、離心去上清、再懸于新培養(yǎng)液中計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104-1×105個(gè)細(xì)胞/ml。如實(shí)體瘤細(xì)胞。

胰蛋白酶濃度太高可造成細(xì)胞裂解和活力的喪失。EDTA的作用是增加細(xì)胞分離，加強(qiáng)胰酶的作用。有時(shí)可用除菌的PBS液Hank’s液、生理鹽水洗細(xì)胞。

細(xì)胞計(jì)數(shù)：用臺(tái)盼藍(lán)染料拒染試驗(yàn)進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法：

4個(gè)大格之和÷4×2×104個(gè)細(xì)胞/ml四．細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇：1．細(xì)胞的凍存：收集細(xì)胞，加入凍存液（懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞5×106-107/ml,貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞3×106-5×106/ml），采取分步的方式達(dá)到臨界凍存點(diǎn)：4℃-45ˊ，-20℃-45ˊ，液氮罐氣態(tài)45ˊ，進(jìn)入液態(tài)保存（也可-80℃低溫冰箱保存）。采取分步的方式達(dá)到臨界凍存點(diǎn)使細(xì)胞內(nèi)部不能形成冰晶和抑制水外流。

凍存液配制：DMSO、甘油是細(xì)胞保護(hù)劑，防止細(xì)胞內(nèi)冰晶