轉(zhuǎn)基因植物的RT-PCR檢測

轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的RT-PCR檢測實(shí)驗(yàn)原理

RNA的多聚酶反應(yīng)（RT-PCR）是以mRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reversetranscription，RT）與PCR，可用于檢測單個細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞中少于10個拷貝的RNA模板。RNA擴(kuò)增包括兩個步驟：在單引物的介導(dǎo)下和逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成RNA的互補(bǔ)cDNA，加熱后cDNA與RNA鏈解離，然后與另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成雙鏈靶DNA，最后擴(kuò)增靶DNA.mRNAcDNAPCR產(chǎn)物一步法：利用同一緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、Taq酶、4種dNTP

直接進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后PCR擴(kuò)增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡化。所需樣品量減少到最低限度，臨床小樣品的檢測非常有利。用一步法擴(kuò)增可檢測出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA。該法可用于低豐度mRNA的cDNA文庫的構(gòu)建及特異cDNA的克隆，并有可能與Taq酶的測序技術(shù)相組合，使得自動反轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序在單管中進(jìn)行。RT-PCR—一步法和兩步法兩步法：由于單管反應(yīng)時RT和PCR都不能在最佳條件下進(jìn)行并且容易相互干擾，常只適宜用基因特異引物擴(kuò)增較短的基因，及定量PCR。兩步法則是將RT和PCR分別進(jìn)行，這樣使得兩個反應(yīng)充分發(fā)揮各自的特點(diǎn)，更為靈活而且嚴(yán)謹(jǐn)，適合那些GC含量、二級結(jié)構(gòu)嚴(yán)重的模板或者是未知模板，以及多個基因的RT-PCR。RT-PCR—一步法和兩步法外源基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)基因表達(dá)基因表達(dá)指基因組中某基因在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄為mRNA和翻譯成蛋白質(zhì)的過程?；虮磉_(dá)的改變預(yù)示著細(xì)胞在分子水平上的變化。它往往是細(xì)胞形態(tài)功能變化之前的變化。DNARNAProtein轉(zhuǎn)錄翻譯目前研究轉(zhuǎn)基因植物外源基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的常用方法1、RT-PCR(RNA)

2、Northernblot(RNA)

3、real-timePCR(RNA

）

反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)mRNAcDNAPCROligodT,逆轉(zhuǎn)錄酶特異性引物,Taq酶用途:獲得所需cDNA片段；檢測基因表達(dá)