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實(shí)驗(yàn)二半定量RT-PCR分析擬南芥葉片PPH基因表達(dá)田亞楠實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解植物葉綠素酶基因的功能2、掌握半定量RT-PCR操作方法3、掌握基因定量分析的方法實(shí)驗(yàn)原理

RT-PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction)是以RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，由人工合成引物介導(dǎo)生成cDNA第一鏈，以此再作為聚合酶鏈反應(yīng)的模板，在TaqDNA聚合酶作用下，擴(kuò)增產(chǎn)生大量DNA片斷。該方法理論上有一個(gè)單拷貝cDNA模板即可完成擴(kuò)增，因此它比較適合作基因表達(dá)的定量研究，是一種常用的具有很高靈敏度和特異性的基因表達(dá)檢測(cè)方法。RT-PCR方法有定量RT-PCR和半定量RT-PCR法，定量PCR法對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和樣本處理的要求較高，而半定量PCR法對(duì)試驗(yàn)條件的要求不高，它的主要特點(diǎn)是選擇一個(gè)比較標(biāo)準(zhǔn)(control)又稱為內(nèi)參基因，以消除試驗(yàn)誤差，樣本間用于比較的值不是絕對(duì)值，而是相對(duì)值，因此稱半定量RT-PCR法。內(nèi)參基因的設(shè)定為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確，可在PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，加入一對(duì)內(nèi)參照基因的特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參DNA，作為對(duì)照。常用的內(nèi)參有GAPDH（3-磷酸甘油醛脫氫酶）、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）、UBQ（泛蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)

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