加減清營湯對h

加減清營湯對h

動脈硬化性疾?。╰ao）是一種慢性閉塞病，以中、小動脈、靜脈節(jié)段性、無菌性炎癥和血管腔內(nèi)血栓形成為特征的。目前尚不清楚病因和發(fā)病機制以及吸煙是公認的主要原因。加減清營湯對TAO的臨床療效已得到證實,動物實驗亦已發(fā)現(xiàn)加減清營湯能夠活血化瘀并改善機體的免疫狀態(tài)。本實驗采用體外細胞培養(yǎng)方法,用H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷模型,加減清營湯用血清藥理學(xué)方法給藥,通過Western印跡法檢測VEGF的表達水平,研究加減清營湯對血管再通、再生、阻止細胞凋亡及細胞保護作用的影響。1實驗材料1.1藥物、試劑和儀器人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞株(ECV304):購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所,中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會。加減清營湯:在清代溫病學(xué)家吳鞠通的清營湯的基礎(chǔ)上結(jié)合王燦暉教授治療脈管炎的經(jīng)驗組合成方,全方由丹參、赤芍、生地、麥冬、連翹、毛冬青等組成,制成100%煎劑(即1mL/1g生藥),藥物由本校國醫(yī)堂門診部藥房提供,符合2005版《中華人民共和國藥典》要求。丹參注射液:江蘇神龍藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號:0506143;RPIM-1640培養(yǎng)粉:GIBCO,USA,批號:2535081;小牛血清:杭州四季青公司;胰蛋白酶:美國Amerso公司,批號:0428S05;二甲基亞砜:上海凌峰化學(xué)試劑有限公司,批號:050718;30%過氧化氫:分析純,上海久憶化學(xué)試劑有限公司,批號20060910;NP40、脫氧膽酸鹽、Tween20、苯甲基磺酰氟(PMSF),美國Sigma公司;VEGF多克隆抗體,北京博奧森公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG,武漢博士德公司;NC膜,美國Millipore公司;Whatman濾紙;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2動物SD雄性大鼠8只,體重(280±20)g,南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心購買,合格證號:SCXK(蘇2002-0031)。1.3置相顯微觀察5%CO2培養(yǎng)箱(NAPCO,USA);倒置相差顯微鏡(Olympus,Japan);DYY-6B型轉(zhuǎn)移電泳儀、DYY-7B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)。2實驗方法2.1去血、除菌、除菌加減清營湯水煎劑給大鼠連續(xù)灌胃3天,每天2次,正常對照組給予等量蒸餾水。于末次給藥后1h(灌藥前禁食不禁水12h),頸動脈取血,以1000r/min離心15min,分離血清,然后56℃30min滅活以除去補體,再用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌,密封后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2分離細胞、培養(yǎng)細胞用傳代人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(ECV304)作細胞培養(yǎng),按照常規(guī)方法復(fù)蘇,將收獲細胞用培養(yǎng)液懸浮后,種植于培養(yǎng)瓶內(nèi),置37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2天,待細胞生長至80%融合時,用于實驗。2.3清營湯藥物血清的活性將對數(shù)生長期的ECV304以105/cm2的密度接種于96孔板,分為5組,待細胞長至融合后,除正常組外,其余各組在造模前均用不含血清的培養(yǎng)液以增強細胞對H2O2損傷的敏感性。即:(1)正常組,含10%小牛血清的培養(yǎng)液;(2)模型組:加H2O2(終濃度為380μmol/L)、不含血清的培養(yǎng)液;(3)血清對照組:加H2O2(終濃度為380μmol/L)、含10%正常大鼠血清的培養(yǎng)液;(4)丹參組:加H2O2(終濃度為380μmol/L)、含10%丹參注射液(終濃度為0.5g/L)的培養(yǎng)液;(5)加減清營湯組:加H2O2(終濃度為380μmol/L)、含10%加減清營湯藥物血清的培養(yǎng)液。操作完成后,置于37℃,5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h。2.4細胞培養(yǎng)和多次吹打收獲對數(shù)生長期的細胞,用50～100μL三去污裂解液(含1%NP-40、50mmol/LTris-HCL、150mmol/LNaCl、0.1mmol/LPMSF和1mg/Laprotinin)重懸細胞并反復(fù)吹打3～5min;混勻后于4℃溫育20min,12000r/min離心20min,取上清作為細胞總蛋白,分裝后置于-20℃?zhèn)溆谩?.5不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠法將細胞總蛋白通過BCA法定量,以確定每個樣品的上樣體積。取50μg的蛋白質(zhì)樣品與等體積的2×SDS上樣緩沖液(100mmol/LtTris-HCL、200mmol/L二硫蘇糖醇、4%SDS、0.2%溴酚藍、20%甘油)混合,于沸水中變性5min,加載于7%或12%Laemmli不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠樣品孔中;以60V(濃縮膠)/120V(分離膠)電泳至溴酚藍抵達凝膠前沿;考馬斯亮藍R-250染色,脫色液脫色后觀察蛋白條帶,以確定最佳電泳條件。2.6凝膠轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移確定最佳電泳條件后,于該條件下跑電泳,取出凝膠用半干式電轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移2h。5%脫脂奶粉4℃封閉過夜,一抗4℃孵育6h,二抗室溫孵育2h,ECL顯色觀察結(jié)果。3血清病理組對vegf表達的影響正常組VEGF由于表達量很低,養(yǎng)化應(yīng)激狀態(tài)下VEGF表達有所增加,加減清營湯血清藥理組則顯著提高H2O2損傷后ECV304中VEGF的表達(見圖1)。4抗血栓能力的檢測TAO是一種病因尚未完全清楚的疾病,臨床上以累及血管的炎癥和閉塞性疾病為主。其主要的病理改變?yōu)檠芮粌?nèi)的血栓形成、血管壁及周圍的廣泛纖維化等。以溫病清營通脈法代表方劑加減清營湯臨床治療結(jié)果表明,清營通脈法能夠明顯改善血栓閉塞性脈管炎患者的臨床癥狀和體征,改善血液流變學(xué)狀態(tài),降低全血黏度和血漿黏度,對機體的免疫能力具有一定的調(diào)節(jié)作用。因TAO患者抗血栓功能的明顯紊亂和內(nèi)皮細胞的自由基損傷有很大關(guān)系,本文著力研究加減清營湯對血管內(nèi)皮細胞的氧化損傷修復(fù)作用,從而從另外的角度來揭示其抗血栓的能力。VEGF作為內(nèi)皮細胞特異有絲分裂原刺激內(nèi)皮細胞增生、促使血管滲漏、刺激細胞遷移。VEGF還可通過誘導(dǎo)Bcl-2的表達、激活MAPK和抑制c-JNK而抗腫瘤細胞凋亡。據(jù)文獻報道,VEGF至少有4種剪接變異體,分別由206、189、165和121個氨基酸殘基組成,其中VEGF206和VEGF189以與細胞表達蛋白多糖結(jié)合的形式存在;VEGF165和VEGF121以可溶性方式分泌。本實驗得到的VEGF的Western印跡圖譜和文獻報道的圖譜一致,即分子量在42kDa左右,上面一條帶為VEGF165,下面一條帶為其變異體。正常組ECV304細胞長至融合后,分裂增