第十章 原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交

第十章原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體培養(yǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法體細(xì)胞雜交（圖）體細(xì)胞雜交技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用

原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的概念及作用原生質(zhì)體的制備（分離）影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的因子原生質(zhì)體的收集與純化原生質(zhì)體活力的測定原生質(zhì)體（Protoplast）的概念及作用定義原生質(zhì)體是指除去全部細(xì)胞壁的“細(xì)胞”，或者是一個(gè)為質(zhì)膜所包圍的“裸露細(xì)胞”。

作用植物原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁，仍可進(jìn)行植物細(xì)胞的各種基本生命活動，非常有利于探討許多細(xì)胞生理問題；植物原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁，可用以進(jìn)行誘導(dǎo)融合，引入細(xì)胞器、大分子、外源遺傳物質(zhì)、低等生物等等，它是理想的起始材料和受體；在同一時(shí)間內(nèi)獲得的大量原生質(zhì)體在遺傳上是同質(zhì)的，可為細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生理學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等提供良好的實(shí)驗(yàn)體系。植物原生質(zhì)體在離體培養(yǎng)條件下能夠再生細(xì)胞壁，繼續(xù)生長和分裂，形成愈傷組織，分化再生成完整植株，即植物原生質(zhì)體仍然保持著細(xì)胞的“全能性”。這就給高等植物細(xì)胞工程和基因工程的發(fā)展提供了誘人的前景。原生質(zhì)體的制備（分離）

機(jī)械法把葉肉細(xì)胞、愈傷組織細(xì)胞或懸浮細(xì)胞放在高滲的糖或鹽溶液中，使之發(fā)生質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮呈球形，然后用利刀切割。此法獲得的原生質(zhì)體數(shù)量很少，手續(xù)精細(xì)而繁瑣，只適用于液泡化的細(xì)胞。酶法兩步法：先用果膠酶處理葉片小塊，使之釋放出單個(gè)細(xì)胞，然后再用纖維素酶消化掉細(xì)胞壁，釋放出原生質(zhì)體。此法獲得的原生質(zhì)體均勻一致且質(zhì)量好。一步法：將纖維素酶和果膠酶配置成混合酶液一起使用。此法由于減少了操作步驟，減少了微生物的污染，是目前經(jīng)常采用的方法。（圖）影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的因子材料的選擇酶的種類、組合和酶解時(shí)間滲透壓的調(diào)控材料的預(yù)處理、滅菌處理PH

材料的選擇一般來說，植物各個(gè)器官，如：根、莖、葉、花、果實(shí)種子及愈傷組織細(xì)胞和懸浮細(xì)胞等都可作為分離原生質(zhì)體的材料。選用愈傷組織或懸浮細(xì)胞系，要注意選擇繼代后處于旺盛分裂時(shí)期的材料；愈傷組織同時(shí)要注意挑選淡黃色、顆粒狀的材料。選用植株上的外植體，一定要注意植株的年齡、生長發(fā)育狀態(tài)、外植體組織器官的成熟度等，即選擇生長健壯植株上較幼嫩的組織。最好事先培養(yǎng)無菌試管苗，可免去消毒程序，提高原生質(zhì)體的活力。酶的種類、組合和酶解時(shí)間選擇純度高的酶類，根據(jù)酶解材料細(xì)胞壁的特性以及酶的活性大小確定適宜的酶液組合。酶的濃度不宜過高，酶解時(shí)間不宜過長，最好不超過8小時(shí)。滲透壓的調(diào)控植物細(xì)胞壁對植物細(xì)胞有良好的保護(hù)作用。去除細(xì)胞壁之后如果溶液中的滲透壓和細(xì)胞內(nèi)的滲透壓不同，原生質(zhì)體有可能漲破或收縮。滲透壓穩(wěn)定劑主要可分為兩大類：一是由糖醇和可溶性糖組成的有機(jī)溶劑，目前大多采用這一類，一般使用甘露醇或山梨醇；另一類是無機(jī)鹽溶液，由氯化鈣、硫酸鎂、氯化鉀或培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽組成。滲透壓穩(wěn)定劑的使用濃度不宜過高或過低，以細(xì)胞輕度質(zhì)壁分離為宜，一般濃度在0.3-0.6mol/L之間。材料的預(yù)處理、滅菌處理材料的預(yù)處理有不少文獻(xiàn)報(bào)道在游離原生質(zhì)之前對材料進(jìn)行預(yù)處理能提高原生質(zhì)體的分裂頻率。這些預(yù)處理包括暗處理、預(yù)處理、低溫處理等。材料的滅菌處理一般來說，滅菌方法與前面介紹的用于組織和器官培養(yǎng)的消毒方法基本相同。

PH酶液的PH對原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力影響很大。植物材料不同，要求的PH有差異。一般為5.5-5.8。如果供體材料是植物組織器官，要在酶液中加PH緩沖劑。原生質(zhì)體的收集與純化原生質(zhì)體的純化方法主要有三種：沉降法、漂浮法和不連續(xù)梯度離心法。沉降法（目前廣泛采用的方法）：將酶解后收集起來的原生質(zhì)體混合液過濾，除去未消化的細(xì)胞團(tuán)塊和篩管、導(dǎo)管等雜質(zhì)，收集濾液；將收集到的濾液離心，用吸管謹(jǐn)慎地吸去上清液；將離心下來的原生質(zhì)體重新懸浮在洗液中，再次離心，去上清液，如此重復(fù)三次；用培養(yǎng)基清洗一次，最后用培養(yǎng)基將原生質(zhì)調(diào)到一定密度進(jìn)行培養(yǎng)。一般原生質(zhì)體的培養(yǎng)密度為5x103—104個(gè)/ml。原生質(zhì)體活力的測定

測定原生質(zhì)體活性有多種方法觀察胞質(zhì)環(huán)流形態(tài)觀察法活性染料染色（酚藏花紅染色法）熒光素雙醋酸酯（FDA）染色原生質(zhì)體培養(yǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法培養(yǎng)基原生質(zhì)體培養(yǎng)和組織培養(yǎng)一樣，培養(yǎng)基中需要大量元素和微量元素做營養(yǎng)源、需要糖類物質(zhì)做碳源、還需要許多有機(jī)營養(yǎng)、需要補(bǔ)充一些內(nèi)源激素。一般采用的是改變了的細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)方法固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)及固液結(jié)合培養(yǎng)。原生質(zhì)體在培養(yǎng)過程中發(fā)生的變化

細(xì)胞壁的形成細(xì)胞分裂和愈傷組織的形成植株的再生（圖）體細(xì)胞雜交體細(xì)胞雜交的概念用人工的方法，把分離的不同品種或不同種的原生質(zhì)體誘導(dǎo)成融合細(xì)胞，再經(jīng)離體培養(yǎng)誘導(dǎo)分化和再生完整植株的整個(gè)過程，以及研究其親代、子代的性狀表現(xiàn)和有關(guān)的理論與實(shí)際問題。體細(xì)胞雜交步驟原生質(zhì)體制備→原生質(zhì)體融合→雜種細(xì)胞選擇→雜種細(xì)胞培養(yǎng)→由雜種組織再生植株→雜種或胞質(zhì)雜種植株的鑒定

原生質(zhì)體融合自發(fā)融合在酶解細(xì)胞壁過程中，有些相鄰的原生質(zhì)體能彼此融合形成同核體，它是由不同細(xì)胞間胞間連絲的擴(kuò)展和粘連造成的

誘導(dǎo)融合指加入誘導(dǎo)劑或用其他方法使兩親本原生質(zhì)體