小鼠前列腺癌原位移植瘤模型的建立及生物學特性觀察

小鼠前列腺癌原位移植瘤模型的建立及生物學特性觀察

前列腺是歐洲和美國最常見的男性腫瘤，在美國，發(fā)病率最高，死亡率最高。隨著人民生活水平的提高和人群普查的開展,我國前列腺癌的發(fā)病率近年來有逐漸增高的趨勢。由于前列腺癌發(fā)病比較隱蔽,在初診時,大約30%～50%的患者有轉(zhuǎn)移發(fā)生,常常喪失了手術(shù)治療的最佳時機。因此,研究在體條件下前列腺癌的生長和轉(zhuǎn)移情況,對前列腺癌的診斷和治療具有重要意義。我們通過原位移植,建立起C57BL6近交系小鼠前列腺癌原位移植瘤模型,并探討此模型在研究有關(guān)前列腺癌生物學特性方面的應(yīng)用價值。材料和方法一、動物動物大學C57BL6雄性近交系小鼠36只,購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。鼠齡8周,體重18～20g,飼養(yǎng)環(huán)境恒溫、恒濕、清潔、無特殊病原體,定期更換墊料,清潔飲用水及飼料供小鼠自由攝入。二、imd培養(yǎng)液的制備小鼠前列腺癌細胞株RM-1購自上海細胞所。用含10%新生牛血清的IMDM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng),以0.25%胰酶消化傳代。三、小鼠低場細胞rp-1C57BL6近交系小鼠10只,用強力碘消毒小鼠背部,取上述RM-1前列腺癌細胞溶液接種于小鼠背部皮下,接種細胞濃度為2×107個/ml,每只接種100μl。隔日觀察腫瘤生長情況。四、腫瘤的切除和重建用于外科原位移植(SOI)的腫瘤組織來源于上述鼠背皮下腫瘤模型。狀態(tài)較好的腫瘤組織靠近外周,色白有光澤,質(zhì)韌有彈性,不易破碎。將取出的瘤塊置于低溫、無菌的0.9%生理鹽水中,在10倍顯微鏡下切割成直徑1.5mm大小的腫瘤塊。C57BL6近交系小鼠用戊巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉,取仰臥位,強力碘常規(guī)消毒,鋪無菌洞巾。下腹部正中切口長約1.5～2.0cm,顯露腹腔。將膀胱向上提起,并用無菌棉簽抵住膀胱腹側(cè)壁,暴露腹側(cè)前列腺。鏡下剝離前列腺腹側(cè)筋膜,用尖刀分離兩腹側(cè)葉,將腫瘤塊置于兩腹側(cè)葉間形成的縫隙中,用9-0可吸收線縫合兩腹側(cè)葉及其表面筋膜,使腫瘤塊被嚴密包埋?；謴团K器原來的解剖位置,用5-0腸線全層連續(xù)縫合關(guān)腹,待鼠蘇醒后回籠。術(shù)中操作要求輕柔、準確,避免損傷正常組織和腫瘤組織。五、動物實驗組共有20只小鼠進行原位移植。2只移植后4d處死,2只移植后8d處死,其余移植后瀕死時處死。六、原位移植的病理組織學觀察小鼠瀕死或處死時采用過量麻醉方法處死,手術(shù)顯微鏡下觀察原位移植的腫瘤生長情況和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況,取肝、肺、脾、腎、椎體、淋巴結(jié)和可疑的骨骼進行福爾馬林固定,石蠟包埋,切片,HE染色后光鏡下觀察有無轉(zhuǎn)移灶。結(jié)果一、切口感染,睡眠良好C57BL6雄性近交小鼠進行RM-1腫瘤塊原位移植術(shù)后,均無意外死亡,無切口感染,進食睡眠良好。平均術(shù)后第8天,仔細觸摸可于下腹部觸及包塊;第15～20天,動物出現(xiàn)一般狀態(tài)衰竭,體重下降明顯,可見下腹塑型,可觸及包塊,質(zhì)硬,切開后見腫瘤直徑多在2.0～3.5cm,動物原位腫瘤發(fā)生率100%。二、組織學觀察小鼠進行RM-1腫瘤塊原位移植術(shù)后第4天未觸及包塊,組織學觀察,前列腺、腫瘤共存,以前列腺為主;第8天,可觸及包塊,以腫瘤為主,少許前列腺;第15～20天,包塊質(zhì)硬,活動性差,全部為腫瘤占據(jù),前列腺組織見不到。三、腫瘤細胞移植原位模型組大體見廣泛地浸潤周圍盆腔臟器(包括膀胱、精囊等),形成固定的實質(zhì)性團塊。可見100%髂動脈和主動脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。其中盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率最高,為16/16;由血行途徑而致的各主要臟器轉(zhuǎn)移灶中,肺的發(fā)生率最高,為8/16。發(fā)生轉(zhuǎn)移的部位共有5處(見圖1)。組織學檢查:見移植瘤內(nèi)有成群的密集的未分化上皮細胞,有豐富的、泡沫樣的嗜酸細胞象,核內(nèi)有多形的、數(shù)目不均的染色質(zhì),前列腺僅見少許腺樣結(jié)構(gòu)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點是腫瘤細胞被膜下皮質(zhì)、髓質(zhì)廣泛浸潤,在許多淋巴結(jié),腫瘤細胞占據(jù)整個淋巴結(jié),幾乎一個淋巴細胞也見不到。皮下模型組小鼠僅見到腫瘤局部的生長與浸潤,未見腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生。四、不同原位模型組小鼠血清中nd皮下模型組小鼠平均生存時間為(33.0±5.6)d,而原位模型組小鼠僅為(17.0±3.5)d,兩者相比差異有非常顯著性(P<0.01)。原位移植腫瘤細胞目前的研究多選擇皮下作為前列腺癌的小鼠模型荷瘤部位,雖然有接種方便、易于觀察等優(yōu)點,但其生物學行為往往僅有腫瘤的局限性生長和浸潤,難以觀察到重要的淋巴和血道轉(zhuǎn)移行為。有研究表明,超聲低回聲反射陽性時,有41.5%的前列腺癌患者在確診時已有轉(zhuǎn)移,可見皮下移植瘤模型并不能很好地模擬前列腺癌在人體內(nèi)的自然生長過程,對于研究其病理生理過程、判別藥物療效存在較大的局限性。根據(jù)Paget的研究,腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于一個合適的微環(huán)境,可以預見原位種植可能具有更高的致瘤率和轉(zhuǎn)移機率。Sato等對比前列腺癌LNCaP細胞懸液分別作SCID鼠皮下和原位種植后的情況,顯示皮下模型組中100%成瘤,無一發(fā)生淋巴結(jié)與遠處轉(zhuǎn)移;原位模型組中89%成瘤,但全部發(fā)生腹膜后和縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,40%發(fā)現(xiàn)有鏡下肺轉(zhuǎn)移。Stephenson等人選用轉(zhuǎn)移特性較強的PC-3M進行腫瘤細胞原位注射,獲得了73%(27/37)的主動脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率。BastideC等報道將人的前列腺癌細胞PC-3和DU-145接種到SCID小鼠體內(nèi)能產(chǎn)生包括淋巴結(jié)、肝、肺、脾、腎和腎上腺在內(nèi)的多個體內(nèi)部位轉(zhuǎn)移灶。但由于小鼠前列腺很小(約50mg),對其進行腫瘤細胞注射需要特別精細的操作,否則很容易溢出而造成人為的腹腔種植,導致模型建立失敗。有研究表明,注入腫瘤細胞后10min～3h,即使沒有直接刺入血管內(nèi),也容易產(chǎn)生自發(fā)的向淋巴道和血道的轉(zhuǎn)移造成人為的播散。而腫瘤細胞植入小鼠后,細胞增殖的前提是有宿主基質(zhì)細胞穿入瘤體,因此腫瘤基質(zhì)對于腫瘤生長有重要作用。有人研究將纖維細胞與腫瘤細胞共同培養(yǎng),而觀察到明顯的纖維細胞刺激腫瘤生長的作用。所以單純細胞注射不僅缺少完整的組織結(jié)構(gòu),而且也容易造成腫瘤細胞的人為播散而非真正的轉(zhuǎn)移。近年來Hoffman等首創(chuàng)外科原位移植技術(shù),利用直接來源于新鮮的外科標本或移植性人腫瘤組織,通過手術(shù)原位移植于裸鼠體內(nèi)以建立腫瘤模型的方法。因為這種方法具有原位移植的優(yōu)點,同時又維持了原有腫瘤組織結(jié)構(gòu)及其生物學特性,因此,移植瘤在裸鼠體內(nèi)能以類似病人體內(nèi)的方式展示其惡性行為,包括轉(zhuǎn)移。該研究組采用改良方法對該模型進行系統(tǒng)性測試,將5個1mm3左右PC-3小瘤塊接種到裸鼠切開的腹側(cè)前列腺左右葉中間部位,3個月后前列腺腫瘤發(fā)生率為19/20(95%),形成腫瘤直徑均大于2cm,使小鼠腹部發(fā)生變形。主動脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率達13/19(68%),且有5/19(26%)小鼠發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移。但由于受選擇腫瘤細胞的生物學特性(惡性程度較低)所決定,模型制作耗時較長而且轉(zhuǎn)移發(fā)生率不是很高。本研究采用鼠源性的RM-1細胞系建立的C57BL6近交系小鼠前列腺癌原位移植瘤模型,模型組的小鼠全部發(fā)生轉(zhuǎn)移,其中盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率最高,為16/16,由血行途徑而致的各主要臟器轉(zhuǎn)移灶中,肺的發(fā)生率最高,為8/16,高于文獻報道,同時原位模型組小鼠的平均生存期明顯低于皮下模型組,亦表明前者較后者更接近于晚期或轉(zhuǎn)移性人癌體內(nèi)的真實情況。前