基于轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5n的劍尾魚(yú)基因組dna克隆與分析

基于轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5n的劍尾魚(yú)基因組dna克隆與分析

西蒙托納1858是科和科的小型溫帶淡水。具有體型小、繁殖周期短、繁殖力強(qiáng)、易飼養(yǎng)等特點(diǎn),可在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行純化培養(yǎng)。20世紀(jì)80年代起,中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所開(kāi)始對(duì)劍尾魚(yú)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化培育,目前已近交繁殖達(dá)21代。生物學(xué)特性、營(yíng)養(yǎng)與飼料、疾病及監(jiān)控等方面的研究表明,劍尾魚(yú)在遺傳學(xué)研究、水環(huán)境污染監(jiān)測(cè)、細(xì)菌性疾病研究方面已初步顯示出較好的應(yīng)用前景。目前,微衛(wèi)星作為多態(tài)DNA標(biāo)記在群體進(jìn)化研究、核基因研究、遺傳連鎖分析和進(jìn)行基因組作圖及基因定位等方面已得到廣泛應(yīng)用。同樣,微衛(wèi)星也是遺傳背景分析(家系、家譜分析)和群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳純度分析的有效手段。在水產(chǎn)動(dòng)物方面,如對(duì)大西洋鮭(SalmosalarL.)、海鱸(Latescalcarifer)、鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)、斑馬魚(yú)(Daniorerio)、尼羅羅非魚(yú)(Tilapianilotica)、金槍魚(yú)(Thunnusthunnus)、香魚(yú)(Plecoglossusaltivelis)等的微衛(wèi)星篩選及應(yīng)用進(jìn)行了許多的研究工作[3,7,9,10,11,12,13,14],其中斑馬魚(yú)作為脊椎動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)的模式動(dòng)物,已經(jīng)構(gòu)建了以微衛(wèi)星為主的遺傳連鎖圖譜。劍尾魚(yú)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化培育工作正在進(jìn)行中,欲將其作為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用,就要對(duì)其遺傳基礎(chǔ)有足夠的認(rèn)識(shí),其中微衛(wèi)星是比較重要的研究工具。因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了劍尾魚(yú)微衛(wèi)星DNA的篩選工作,旨為劍尾魚(yú)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化育種工作提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1試劑和測(cè)量方法紅色劍尾魚(yú)來(lái)自市場(chǎng)和珠江水產(chǎn)研究所培育的19代近交系(RR-B系,紅眼紅體)劍尾魚(yú)。限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶及相關(guān)試劑購(gòu)自Promega公司或華美生物工程公司。DNAGelExtractionKit、AgaroseGelDNAExtractionKit和WizardDNAPurificationSystem分別為上海生工、ROCH和Promega公司產(chǎn)品。引物(AC)7、(GT)7重復(fù)序列由上海生工公司合成。大腸桿菌DH5α和質(zhì)粒pUC18由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2劍尾魚(yú)飼料數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建1.2.1dna電泳檢測(cè)DNA的提取和酶切取肝臟20mg,用Wizard基因組DNA提取與純化試劑盒介紹的方法提取基因組DNA。電泳檢測(cè)DNA的完整性和純度并估計(jì)其濃度。按體積比1:1混合2尾魚(yú)的總DNA,經(jīng)MboⅠ限制性?xún)?nèi)切酶部分酶切后(通過(guò)設(shè)計(jì)酶切梯度來(lái)確定酶的量),1%瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物,切下含有500～2000bp片段的凝膠,用DNAGelExtractionKit回收純化DNA。1.2.2pcr檢測(cè)乳酸菌dh5質(zhì)粒pUC18用BamHⅠ完全酶切后,小牛堿性磷酸酶(CIAP)去磷酸化,經(jīng)AgaroseGelDNAExtractionKit試劑盒純化后,將載體與回收的目的DNA按1:3的比例連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布于表面涂有X-Gal和IPTG的氨芐青霉素LB平板上,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。1.3pcr擴(kuò)增及程序重組質(zhì)粒的提取參照《分子克隆》(J.Sambrooketal.1989)的堿裂解法。以重組質(zhì)粒為模板,pUC18多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的M13pUCSequencing/ReverseSequencingPrimer和人工設(shè)計(jì)合成的重復(fù)7次的(AC)(GT)雙核苷酸引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,即:M13S/(AC)7、M13SR/(AC)7、M13S/(GT)7、M13SR/(GT)7。25μL的反應(yīng)體系中含有10×Buffer2.5μL,Mg2+2mmol/L,dNTPs200μmol/L,5′和3′端引物各1pmol/μL,Taq酶1.5U。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min后進(jìn)入循環(huán)體系,94℃變性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸7min。將擴(kuò)增產(chǎn)物于含有EB(0.5μg/mL)的1%的瓊脂糖凝膠中電泳,電泳結(jié)果用UVP凝膠分析儀M-20觀察并拍照存盤(pán)。1.4質(zhì)粒提取與分析選取含有微衛(wèi)星序列的重組陽(yáng)性克隆,用WizardDNAPurificationSystem的方法提取純化質(zhì)粒后,在ABIPRISMTM377全自動(dòng)熒光測(cè)序儀上測(cè)序,DNA分析軟件vectorNTIsuite6.0分析找出序列中的微衛(wèi)星DNA。1.5dnapcr擴(kuò)增根據(jù)其中3個(gè)克隆微衛(wèi)星的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增劍尾魚(yú)基因組DNA,引物序列及退火溫度見(jiàn)表2。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。1.6熒光定量測(cè)序克隆5的引物分別擴(kuò)增野生型和近交系的劍尾魚(yú)基因組DNA,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCRCleanupKit純化后,在ABIPRISMTM377全自動(dòng)熒光測(cè)序儀上測(cè)序。DNA分析軟件vectorNTIsuite6.0分析測(cè)序結(jié)果。2檢測(cè)微衛(wèi)星序列及引物篩選(1)通過(guò)(AC)7、(GT)7引物對(duì)劍尾魚(yú)的部分基因組文庫(kù)的120個(gè)重組陽(yáng)性克隆(白色菌落)的PCR擴(kuò)增篩選,初步獲得9個(gè)(7.5%)含有微衛(wèi)星序列的克隆。對(duì)這9個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序,結(jié)果獲得24個(gè)微衛(wèi)星序列(表1)。其中(GT/CA)n12個(gè),占50%;(TC)n7個(gè),占29%;(TA)n3個(gè),占12.5%。根據(jù)Weber(1990)提出的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),這些微衛(wèi)星可分為3類(lèi),即Perfect(完美型)、Imperfect(非完美型)和Compound(混合型)。Perfect指沒(méi)有中斷的或附近無(wú)其他重復(fù)序列的重復(fù)序列;Imperfect指2個(gè)或2個(gè)以上的同種重復(fù)序列,被3個(gè)堿基以下的非重復(fù)序列所間隔;Compound指一種重復(fù)序列與其他種類(lèi)的重復(fù)序列被3個(gè)堿基以下的非重復(fù)序列所間隔。對(duì)本實(shí)驗(yàn)獲得的24個(gè)微衛(wèi)星序列進(jìn)行劃分,其中Perfect13個(gè)占54.2%、Imperfect3個(gè)占12.5%和Compound8個(gè)占33.3%。另外,本次篩選到的微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)多數(shù)為3～10次。(2)PCR法篩選含有劍尾魚(yú)微衛(wèi)星序列的部分陽(yáng)性克隆的電泳圖見(jiàn)圖1,2號(hào)克隆在A、D兩組引物均擴(kuò)增出特異帶,即泳道A2和D2,大小分別為1000bp和200bp和用正反M13引物PCR檢測(cè)到插入片段大小1200bp相符,說(shuō)明2號(hào)克隆中含有微衛(wèi)星序列。(3)根據(jù)3個(gè)克隆的微衛(wèi)星序列所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增劍尾魚(yú)基因組DNA,均擴(kuò)增到目的片段,其大小分別為440bp左右、360bp左右和370bp左右(表2)。(4)3對(duì)引物對(duì)非選育種和近交系RR-B系19代的擴(kuò)增,結(jié)果這3個(gè)微衛(wèi)星在非選育劍尾魚(yú)中顯示出多態(tài)性,而在19代近交系的品系則呈現(xiàn)單態(tài)。其中Clone5引物的擴(kuò)增結(jié)果及序列比較結(jié)果分析見(jiàn)圖2、3。(5)Clone5引物的擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物,測(cè)序得到3個(gè)等位基因,其大小分別為343bp、370bp、385bp(箭頭所示),近交系的擴(kuò)增條帶單一,均為385bp。其序列比較結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢?jiàn),微衛(wèi)星重復(fù)序列部分及最接近重復(fù)序列的側(cè)翼序列的堿基變異比較大,其變異除了重復(fù)次數(shù)的差異以外,還有堿基的插入、缺失和突變等。3微衛(wèi)星的擴(kuò)增及檢測(cè)(1)目前,多數(shù)研究是采用同位素標(biāo)記的簡(jiǎn)單重復(fù)核苷酸探針雜交篩選小片段基因組文庫(kù),靈敏度較高,但因其操作對(duì)人體有一定的危害,且步驟繁瑣,包括探針的合成、同位素標(biāo)記、轉(zhuǎn)膜和放射自顯影等步驟。用PCR的方法篩選,操作簡(jiǎn)便快捷,且沒(méi)有同位素污染等特點(diǎn),但PCR方法過(guò)于靈敏,經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)非特異帶,但可以通過(guò)改善PCR條件如調(diào)節(jié)退火溫度來(lái)減少非特異帶的產(chǎn)生或通過(guò)陰性克隆的對(duì)照來(lái)篩選。徐鵬等曾以菌液為模板PCR法篩選到中國(guó)對(duì)蝦31個(gè)微衛(wèi)星DNA,本實(shí)驗(yàn)為了排除大腸桿菌基因組DNA的影響,以堿裂解法提取的質(zhì)粒為模板PCR法篩選到24個(gè)劍尾魚(yú)的微衛(wèi)星DNA,從而證明了此方法的可行性。(2)微衛(wèi)星自20世紀(jì)90年代初用于分子標(biāo)記以來(lái),已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、家系分析以及遺傳疾病的診斷等方面。但在劍尾魚(yú)的微衛(wèi)星篩選及應(yīng)用上,除最近Seckinger等從X.montezumae篩選到10個(gè)微衛(wèi)星以外,未見(jiàn)有其他報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)篩選到劍尾魚(yú)24個(gè)微衛(wèi)星,為以后用微衛(wèi)星來(lái)評(píng)價(jià)劍尾魚(yú)近交系遺傳純度打下了基礎(chǔ)。對(duì)魚(yú)類(lèi)的微衛(wèi)星研究可知,魚(yú)類(lèi)微衛(wèi)星中以(GT/CA)n的數(shù)量居多,因此,本實(shí)驗(yàn)以重復(fù)7次的(AC)(GT)雙核苷酸為引物,從劍尾魚(yú)的部分基因組DNA文庫(kù)中的120個(gè)陽(yáng)性克隆中篩選到9個(gè)含有微衛(wèi)星序列的克隆,測(cè)序得到24個(gè)微衛(wèi)星序列中(GT/CA)n12個(gè),占50%,表明在劍尾魚(yú)的基因組DNA中,(GT/CA)n的含量非常豐富。利用其中3個(gè)克隆序列的核心序列及旁側(cè)序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增到了劍尾魚(yú)多態(tài)性的等位片段,而擴(kuò)增近交系RR-B系的結(jié)果則呈單一的一條帶,李霞等曾用RAPD的方法證明近交系RR-B系的遺傳純度為0.9840,3對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)近交系的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)一步佐證了RR-B系的純合度。因而這3個(gè)序列可以作為標(biāo)記來(lái)進(jìn)行劍尾魚(yú)的遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性分析、種質(zhì)鑒定、