慢性復發(fā)性關節(jié)炎的病理學研究

慢性復發(fā)性關節(jié)炎的病理學研究

3預防預防并發(fā)癥的機制如圖1所示，在大鼠關節(jié)模型中確定克隆易感基因：該基因屬于經(jīng)典的純系育種分離技術，與合并系統(tǒng)和重組系統(tǒng)的建立相結合，減少了易感區(qū)域。最后，確定遺傳因素的變化、功能變化以及關節(jié)表型之間的關系。具體步驟見圖1。在數(shù)種關節(jié)炎模型中,用于進行基因定位克隆的模型有:膠原誘導性關節(jié)炎、油誘導性關節(jié)炎和Pristane誘導的關節(jié)炎。我們的研究工作主要采用PIA。PIA是用150μLPristane一次性皮下注射,在易感的大鼠中,從注射后8d,外周小關節(jié)開始發(fā)紅發(fā)腫,3周時炎癥達到高潮,幾乎所有外周小關節(jié),包括近節(jié)指間關節(jié)(趾間關節(jié))、掌指關節(jié)(跖趾關節(jié))、腕關節(jié)(踝關節(jié)),均可累及。4周后,炎癥逐漸消退。40d后,又可在已受累關節(jié)重新出現(xiàn)炎癥,或可在未受累關節(jié)出現(xiàn)炎癥,但往往沒有第一次炎癥嚴重。故認為PIA是一種慢性復發(fā)性的關節(jié)炎,最能代表RA的特征。PIA的病理學改變主要為:①早期的滑膜炎。表現(xiàn)為滑膜增厚,細胞數(shù)目增多,滑膜間質有大量炎性細胞侵入,主要為多形核白細胞、淋巴細胞,細胞可成團成簇,形成巢狀結構,嚴重時巢狀細胞的中心又大量壞死,形成囊腔;大量的新生血管形成,由增厚的滑膜形成的血管翳突出于關節(jié)腔,覆蓋在關節(jié)軟骨的表面。②軟骨和骨的侵蝕。在嚴重的炎癥過程中,大量的炎癥細胞,主要是巨噬細胞,侵蝕骨和軟骨,甚至炎癥部位可和骨髓相連,炎癥部位的骨髓腔也可充滿炎癥細胞。③關節(jié)結構破壞。由于炎癥的破壞,關節(jié)的正常結構消失,關節(jié)腔被纖維組織或軟骨骨組織所替代,形成纖維或軟骨和骨的僵直。④新生軟骨和骨的形成。在慢性炎癥時,除有大量的巨噬細胞、淋巴細胞外,在炎癥部位有纖維組織衍生的軟骨組織和骨組織形成。這些病理學改變和RA時在關節(jié)的病理學改變非常相似。另外,PIA和傳統(tǒng)的佐劑性關節(jié)炎不同,很少有其他器官的累及。PIA大鼠中的血液中也可檢測到類風濕因子,一些炎性因子如急性反應蛋白和細胞因子均增高,而反應軟骨破壞的血清生化指標如軟骨寡基質蛋白(COMP)也增高。在關節(jié)炎的動物實驗中,評價關節(jié)炎的發(fā)病和嚴重程度常采用大體的記分法。主要有簡單記分系統(tǒng)和復雜記分系統(tǒng),簡單記分系統(tǒng)總分為16分,四個爪子,每個爪子所有關節(jié)有炎癥(表現(xiàn)為紅腫)計4分,僅有一個小關節(jié)有炎癥計1分,兩個小關節(jié)或僅有踝(腕)關節(jié)受累者計2分,所有小關節(jié),或1個小關節(jié)和踝(腕)關節(jié)有炎癥計3分。復雜記分系統(tǒng)總分為60分,將每個爪子分為三部分,即踝(腕)部、中部及趾(指)部,每個部分最高分5分,每部1個趾有炎癥計1分,每爪最高分15分。評價炎癥的指標有:患病率、每觀察天的患病率曲線、發(fā)病時間、平均最大記分,每觀察天的平均記分曲線等。常用的統(tǒng)計學方法是卡方檢驗和秩和試驗。也有的實驗室采用簡單的設備測定關節(jié)體積(jointvolume)、關節(jié)周長、爪中部厚度等的改變,反映炎癥的程度。我們用于關節(jié)炎易感基因定位的近交系(inbred)大鼠為DA、LEW.1F和E3,三個近交系對不同關節(jié)炎的易感性歸納整理見表2。分離育種中,首先要選擇親代近交系,一般來說,選擇最易感的近交系和最不易感的近交系交配,生產子一代(F1)大鼠,F1代大鼠每個個體的遺傳背景相同,對疾病的易感性差異反映了環(huán)境因素的差異。F1代鼠互交產生的F2大鼠,不同基因位點進行了分離,也就是說由于基因的重組每個大鼠都可能攜帶著不同的基因。對F1代和F2代大鼠分別誘導關節(jié)炎,觀察各種表型,包括發(fā)病時間、嚴重程度、最大嚴重程度指數(shù)等反映疾病的指標以及反映免疫反應的自身抗體、DTH、細胞亞型、細胞因子和炎性介質等改變。計算各變量的方差。在F1代大鼠中,由于所有大鼠的基因是相同的,各變量的方差主要反映了環(huán)境因素的作用。而F2代大鼠中各變量的方差既反映了環(huán)境因素的作用,也有各大鼠間遺傳因素的作用。采用STR遺傳標記,大約每10-20cM選擇一個有效STR標記,進行每個大鼠的全基因組掃描,獲得每個大鼠的基因型。在計算機軟件的幫助下,對每個表型,如發(fā)病、發(fā)病時間、嚴重程度等和基因型,進行連鎖分析,計算出QTLs,以LOD值大于2.8為提示有連鎖,3.8為有連鎖顯著性差異。在我們對PIA的研究中,已經(jīng)確定了15個QTLs,一并歸納整理如表3。一旦確定QTLs,需要建立congenic系大鼠,以窄化QTLs區(qū)域,直到能夠進行位置克隆易感基因。經(jīng)典的建立congenic系的方法是在STR標記的幫助下,反復回交來自于抵抗系的QTLs區(qū)域到易感的近交系大鼠,也可采用相反的策略,取決于各QTL的遺傳模式。在PIA4的研究中,我們反復回交E3大鼠的PIA4位點到易感的DA大鼠,經(jīng)過十幾代的回交,除PIA4位點外,其余的基因位點幾乎和DA相同,我們稱這種congenic大鼠為DA.PIA4E3大鼠。在此基礎上,互交產生一系列重組DA.PIA4系,通過表型鑒定,SNPs標記確定染色體區(qū)域,我們發(fā)現(xiàn)一重組系大鼠,不但對PIA關節(jié)炎,而且對CIA的表型也有顯著性影響,該區(qū)域不足2cM,為此后的位置克隆打下了基礎。建立congenic系,耗時且易于丟失表型。以保守估計,需2-3年時間,期間還要不斷地驗證表型,以觀察易感基因的效應是否存在。為了解決這一問題,有的研究者采用快捷congenic技術。這種方法和經(jīng)典方法的不同是,依據(jù)統(tǒng)計學原理,在全基因組STR標記的幫助下,既選擇目的QTLs區(qū)的標記來源于供體基因組,也選擇其他基因組區(qū)域的標記和受體基因組近可能的一致的大鼠,與受體回交。理論上說,經(jīng)過5-6代的這種回交,可達到和經(jīng)典方法一樣的效果。美國大鼠基因組協(xié)作組建立了一組具有統(tǒng)一的遺傳背景,只有一條染色體不同的congenic大鼠系,稱之為consomic大鼠,以利于研究者窄化QTLs所需時間。另外,也有以表型為篩檢手段,建立congenic系,即在確定受體和供體基因組后,回交大鼠的選擇是采用表型的改變來確定。這種方法雖然避免表型的丟失,但給后面的位置克隆帶來很大不便,甚止難以進行,故應用較少。得到1cM的congenic大鼠,既可進行位置克隆基因。理論上講,1cM大體相當于1Mb的堿基,約含有10個基因,有必要在SNPs和STR等序列標記位點(STS)的幫助下,確定該區(qū)域的物理圖譜。鑒于大鼠基因組序列已經(jīng)完成,此項工作目前已不難進行。我們在PIA4的研究中,由于大鼠基因組計劃尚未完成,首先需要從基因組YAC文庫構建contig,幸運地發(fā)現(xiàn)該區(qū)域只有兩個基因,測序比較DA和E3大鼠兩個基因序列的差異,只發(fā)現(xiàn)NCF1基因兩者間存在著多態(tài)性。我們認為:NCF1可能是PIA4的易感基因。當然,也有其他的研究策略,如侯選基因法,在QTLs區(qū)域內,選擇可能和疾病發(fā)生發(fā)展有關的基因,進行測序,對比分析,以確定易感基因。另外,可以與DNA芯片結合,即將區(qū)域內的基因或ESTs點在芯片上,比較congenic系和對照在mRNA水平的差異。可能最大差異者就是易感基因,用此方法,己有獲得成功的報道。但是,如果mRNA表達無差異,而蛋白質的結構改變,難以達到滿意的結果。復雜性疾病的易感基因,往往表現(xiàn)為多態(tài)性,較少地表現(xiàn)為基因的沉默,即無功能蛋白的表達。這些多態(tài)性可存在于編碼區(qū),更多地存在于基因的非編碼區(qū)。如果確定為疾病的易感基因,一定有基因的改變對基因功能的影響。同時在轉基因小鼠,包括基因敲除、敲入小鼠中,均對疾病的發(fā)生有影響。另外,針對易感基因的靶向干預,能夠達到預期的目的。采用動物模型尋找關節(jié)炎的致病基因,對大鼠純系間的互交或回交,在大量的遺傳標記幫肋下,通過連鎖分析,進而通過選擇性回交,建立重組系以達到精確定位基因,克服了上述在人群研究中遇到的諸多問題,而且,動物模型可以有效地控制和操作環(huán)境因素,這樣有利于檢測基因的功能。迄今為止,我們從采用Pristane誘導的關節(jié)炎和II型膠原誘導的關節(jié)炎大鼠模型已篩選出十余個調節(jié)關節(jié)炎的非MHC基因位點,在此基礎上克隆的Pia4基因被鑒定為是中性粒細胞胞漿因子1(Ncf1),這說明此一研究策略是完全可行的,并且可能發(fā)現(xiàn)新的功能基因或已知基因的新功能。由于人類和大鼠基因組制圖的研究揭示了不同物種之間存在著高度的同源區(qū),而且不同炎癥性疾病不論在人類還是嚙齒類動物基因組上都分享著相同的基因區(qū)域或簇。所以利用該新模型進行遺傳分析,將為RA的易感基因定位、分子機理研究以及新藥研發(fā)等提供重要理論依據(jù),而且,這項研究也將有利于其他復雜性疾病特別是慢性炎癥疾病易感基因的鑒定和克隆。3.1選擇親代交系，建立關節(jié)炎模型3.2通過分離育種、香氣分析和確定定量遺傳點qlc3.3建立一個狹窄的區(qū)域，并將狹窄化趨勢暴露開來3.4位置克隆基因3.5基本資料和支持致謝:本研究得到theAnnaGretaCrafoordFoundationforRheumatologicalResearch,KingGustafVue78ds80-YearFoundation,theKockandOsterlundFoundations,theSwedishAssociationAgainstRheumatism,theSwedishMedicalResearchCouncil,EuropeanUnionProjectQLG1-CT2001-01407,theSwedishFoundationforStrategicResearch,theBeijerFoundation,theNilsson-EhleFoundation,andtheSwedishSocietyforMedicalResearch經(jīng)費支持。感謝瑞典隆德大學在我作為訪問學者及博士生學習期間的資助;感謝theAnnaGretaCrafoordFoundationforRheumatologicalResearch對我博士后研究