原位核酸雜交課件

原發(fā)性硬化性膽管炎FISH膽管癌細(xì)胞刷檢順序單分子熒光原位雜交

（seqFISH）本月《Nature》報道美國華裔蔡龍團(tuán)隊開發(fā)用于研究單細(xì)胞中哪些基因是活躍的：一個細(xì)胞中超過200個基因的表達(dá)水平體內(nèi)分析：追蹤第八章

核酸分子生物學(xué)基礎(chǔ)第二節(jié)DNA的變性與復(fù)性遲菁華一、DNA變性

(DNAdenaturation)

定義：雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成單鏈無規(guī)則線團(tuán)，因而發(fā)生性質(zhì)改變→不涉及一級結(jié)構(gòu)的改變性質(zhì)改變：粘度下降：單股結(jié)構(gòu)柔軟而松散→沉降速度增加，浮力上升

紫外吸收增加：增色效應(yīng)旋光性改變：對稱性及局部的構(gòu)形改變DNA變性影響因素：①加熱；②改變pH；③有機(jī)溶劑：醇、尿素、酰胺等

增色效應(yīng)(hyperchromiceffect)：紫外吸收作用增強(qiáng)→260nm波長→堿基外露

溶解曲線：以溫度對紫外吸光率作圖，得到DNA變性曲線。當(dāng)溫度升高到一定范圍時，DNA溶液在260nm處的吸光度突然明顯上升至最高值，隨后即使溫度繼續(xù)升高，其吸光度也無明顯變化→DNA變性是在一個很窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的。DNA變性融解溫度(meltingtemperature,Tm)：50%DNA分子發(fā)生變性的溫度，這一現(xiàn)象和結(jié)晶的融解相類似。影響Tm的因素：pH：極端pH值離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度上升，Tm值隨之增大堿基比例：Tm值由G-C堿基配對的含量決定分子長度：核酸分子越長，Tm值越大變性劑：降低Tm值

二、DNA復(fù)性

(DNArenaturation)定義：變性DNA只要消除變性條件，二條互補(bǔ)鏈可以重新結(jié)合，恢復(fù)原來的雙螺旋結(jié)構(gòu)退火：DNA熱變性后，將溫度緩慢冷卻，維持在比Tm低25-30℃左右時，變性后的單鏈DNA即可恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)復(fù)性后的DNA，理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。影響復(fù)性速度的因素溫度和時間：變性DNA溶液在比Tm低25℃的溫度下維持一段長時間,其吸光率會逐漸降低。比Tm低25℃左右的溫度是復(fù)性的最佳條件。溫度過高，有利于DNA變性而不利于復(fù)性；在很低的溫度下,不利于雙鍵間隨機(jī)形成的錯配氫鍵的斷裂。復(fù)性時溫度下降必須是一緩慢過程。降溫時間太短以及溫差大均不利于復(fù)性。

影響復(fù)性速度的因素DNA順序的復(fù)雜性：順序簡單的DNA分子，復(fù)性很快。順序復(fù)雜的DNA,復(fù)性較慢。DNA片段的大?。捍蠓肿覦NA擴(kuò)散速度較慢，復(fù)性較慢。DNA濃度：DNA濃度愈高，復(fù)性速度愈快離子強(qiáng)度：較高時，復(fù)性速度較快。復(fù)性的程度DNA濃度：較高時，有利于復(fù)性信息含量的多少：病毒DNA比動物DNA容易復(fù)性第九章原位核酸分子雜交技術(shù)定義：簡稱原位雜交(insituhybridization)，是應(yīng)用已知堿基順序并帶有標(biāo)記物的核酸探針與組織、細(xì)胞中待檢測的核酸按堿基配對的原則進(jìn)行特異性結(jié)合而形成雜交體，然后再應(yīng)用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測系統(tǒng)，通過組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在被檢測的核酸原位形成帶顏色的雜交信號，在顯微鏡或電子顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。①探針合成；②原位雜交：互補(bǔ)的堿基序列；③顯色；④定位意義：可在原位研究細(xì)胞合成的某種蛋白質(zhì)或多肽的基因表達(dá)→從分子水平研究細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)及有關(guān)基因調(diào)控第一節(jié)原位核酸分子雜交技術(shù)的發(fā)展分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合創(chuàng)立：1969年美國耶魯大學(xué)Gall和Pardue首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交發(fā)展：同位素標(biāo)記探針：細(xì)胞、組織以及病毒DNA非放射性標(biāo)記探針：①熒光素；②DNP（2,4-二硝基苯甲醛）+抗DNP酶標(biāo)抗體+過氧化物酶底物；③生物素-抗生物素；④地高辛：可以檢測蛋白和基因雙重表達(dá)原位核酸分子雜交技術(shù)的發(fā)展核酸探針分類：標(biāo)記方法：放射性、非放射性性質(zhì)：DNA（單鏈、雙鏈）、RNA、cDNA、cRNA、寡核苷酸原位雜交分類：DNA-DNA，cDNA-RNA、RNA-RNA、寡核苷酸-DNA或RNA技術(shù)基礎(chǔ)：分子生物學(xué)→分子克隆、質(zhì)粒和噬菌體第二節(jié)原位分子雜交技術(shù)的基本方法原位雜交的基本方法：雜交前難備：取材、固定、玻片的處理，如何增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等雜交雜交后處理顯示：放射自顯影和非放射性標(biāo)記的組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)顯色一、取材、固定盡快固定的目的：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)最大限度地保存細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平減少RNA的降解：迅速固定或液氮冷凍定位：DNA：穩(wěn)定RNA：固定劑的種類、濃度和固定的時間十分重要取材、固定固定劑：4%多聚甲醛：最常用，不會影響探針穿透入細(xì)胞或組織醋酸-酒精混合液和Bouin液：增加探針的穿透性，RNA↓，組織收縮mRNA的定位：①多聚甲醛1-2h→15%蔗糖4℃冰箱過夜→冰凍切片；②液氮冷凍→切片→多聚甲醛10min→-70℃；③冷凍切片→多聚甲醛蒸汽石蠟包埋標(biāo)本：雜交信號低二、玻片和組織切片的處理1.玻片的處理：蓋玻片和載玻片去除RNA酶：熱肥皂水→自來水→清潔液24h→95%酒精浸泡24h→蒸餾水沖洗→烘干過夜：150℃或以上

硅化：蓋玻片和載玻片，浸于DMDC（二甲二氯硅烷），用錫箔紙包裹。硅化玻片不產(chǎn)生氣泡。蓋玻片自身有一定的重量→

均勻覆蓋和防止蒸發(fā)；載玻片可防止脫片現(xiàn)象。粘附劑：常用多聚賴氨酸液和氨丙基三乙氧基硅烷(APES)丙酮液→垂直烤片→易出現(xiàn)氣泡2.增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性方法：TritonX-100：聚二乙醇辛基苯基醚，去污劑；增加探針對細(xì)胞膜的通透性消化酶：蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶等→用量和時間蛋白酶K的消化作用濃度及孵育時間：視組織種類、固定劑種類、切片的厚薄而定應(yīng)用：100μg/ml37℃孵育15-20min；加入EDTA終止：甘氨酸再固定：多聚甲醛

3.減低背景染色雜交前：用稀鹽酸

(0.2mol/L)處理10分鐘，再結(jié)合蛋白酶消化，可避免堿性蛋白與核酸之間的非特異性結(jié)合。乙酸酐和三乙醇胺預(yù)雜交：用不含探針和硫酸葡聚糖的預(yù)雜交液預(yù)先孵育標(biāo)本，以阻斷非特異性位點雜交后：用低濃度的RNA酶溶液洗滌，以減少殘留的RNA4.防止RNA酶的污染只需要少量RNA酶的存在就會引起RNA的降解。整個雜交前處理過程都需帶消毒手套：手汗、唾液、灰塵→一次性口罩、帽子、手套所有玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實驗前置高溫（240℃）烘烤：溫度必須在150℃以上。其他：石蠟標(biāo)本切片時還需75%酒精擦洗工作臺和切片刀；展片需用高壓消毒過的蒸餾水/超純水；設(shè)置RNA實驗專用實驗室，所有器械應(yīng)為專用三、雜交(hybridization)將探針與靶核酸結(jié)合形成雜交體→“短兵相接”、最關(guān)鍵雙鏈→變性處理加蓋玻片：將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片，或采用無菌的蠟?zāi)ご婀杌纳w玻片，防止雜交液的蒸發(fā)；周圍加液體石蠟/橡皮泥封固。濕盒孵育：盛有少量5×SSC或2×SSC溶液；最佳雜交溫度多數(shù)為37℃-42℃

四、雜交后處理漂洗目的：除去過剩探針，解除非特異性結(jié)合→

非嚴(yán)格堿基配對的雜交體鹽溶液：一系列不同濃度、不同溫度。原則是鹽濃度由高到低，而溫度由低到高。洗滌過程中至少有一次高嚴(yán)格度條件(低鹽、高溫、高甲酰胺)下的漂洗。雜交后處理RNA酶液：RNA-RNA雜交體不受影響。試劑不能含有對RNA酶有抑制作用的物質(zhì)，如還原劑和甲酚胺等。注意：勿使切片干燥五、顯示雜交體檢測系統(tǒng)，因探針標(biāo)記物而異放射性核素標(biāo)記探針的檢測：放射自顯影非放射性標(biāo)記探針的檢測：熒光素標(biāo)記探針：熒光顯微鏡辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記探針：酶促反應(yīng)，同免疫組化染色半定量測定：嚴(yán)格控制實驗的同一條件六、對照實驗和結(jié)果的判斷對照實驗的設(shè)置應(yīng)根據(jù)核酸探針和靶核酸的種類以及現(xiàn)有的條件選定→3～4種探針對照：（1）吸收實驗：將標(biāo)記探針先同互補(bǔ)的DNA或RNA預(yù)雜交→陰性探針對照（2）已知陽性或陰性組織對照：在已知含靶核酸序列的陽性組織和不含靶核酸序列的陰性組織標(biāo)本上進(jìn)行雜交。陽性組織出現(xiàn)陰性→對探針的制備及各個步驟進(jìn)行檢查；陰性組織出現(xiàn)陽性→非特異性信號（3）用同義RNA探針進(jìn)行雜交：檢測mRNA時常用反義RNA探針。同義RNA探針→陰性雜交反應(yīng)對照（1）空白實驗：將雜交液中除去核酸探針→陰性（2）將切片用核酸酶預(yù)處理：DNA酶或RNA酶→雜交信號明顯減弱。以核酸酶預(yù)處理標(biāo)本并不能使雜交信號完全消失。在酶處理后，需把酶清除干凈，以免殘留的酶破壞探針而導(dǎo)致錯誤結(jié)論。組織對照（1）Southern或Northern印跡反應(yīng)：提取DNA或總RNA→

結(jié)果與原位雜交一致。陽性細(xì)胞比例很小時，原位雜交可能為陽性，而印跡反應(yīng)呈陰性。（2）免疫組織化學(xué)：證明蛋白質(zhì)和相應(yīng)的mRNA共存于同一細(xì)胞中檢測系統(tǒng)對照（1）放射自顯影檢測系統(tǒng)對照：陽性對照是將浸漬乳膠的空白片在光線下曝光后顯影。陰性對照是將空白片浸乳膠后不經(jīng)曝光便與雜交標(biāo)本一起進(jìn)行顯影。如果陰性對照片上有較多銀粒，應(yīng)換用新乳膠。（2）非放射性原位雜交檢測系統(tǒng)對照：免疫組織化學(xué)的一系列陽性和陰性對照第三節(jié)原位分子雜交方法

原位雜交分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交較多見一、原位DNA和DNA分子雜交DNA-DNA雜交：在雙鏈DNA經(jīng)熱變性成為單鏈狀態(tài)以后，放在適當(dāng)?shù)柠}濃度和溫度的條件下，二條單鏈的DNA又會恢復(fù)成原來的雙鏈結(jié)構(gòu)。不同種類的DNA不能形成雙鏈結(jié)構(gòu)→可分析不同生物品種來源的兩條或多條DNA鏈間彼此關(guān)系密切程度→染色體原位雜交及對染色體中的DNA進(jìn)行定位DNA探針：①多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。②多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖；不易降解。③標(biāo)記方法：缺口平移法，隨機(jī)引物法，同位素和非同位素標(biāo)記。④缺點：易自身粘連，雙鏈探針使用前需變性處理。

切口平移法是實驗室最常用的一種脫氧核糖核酸探針標(biāo)記法。利用E.coliDNA多聚酶I的多種酶促活性將標(biāo)記的dNTP摻入到新合成的DNA鏈中從而形成高比活性的均勻標(biāo)記的DNA探針。探針標(biāo)記物20多種放射性標(biāo)記物：32P、3H、35S、14C、125I等，敏感性高，但存在輻射危害，有半衰期限制，檢測時間長，成本高，因此應(yīng)用受到了限制。非放射性標(biāo)記物酶類：HRP和AKP等半抗原：地高辛及生物素等熒光素：異硫氰酸熒光素(FITC)等

敏感性不如放射性標(biāo)記探針，但其穩(wěn)定性和分辨率高，檢測時間短，且操作簡便，成本低，不存在安全問題，因此應(yīng)用日趨廣泛。（一）地高辛(Digoxigenin,Dig)標(biāo)記的DNA探針檢測石蠟切片病毒DNADig：又稱異羥基洋地黃毒甙配基，是類固醇半抗原，其抗體與任何固醇類似物無交叉反應(yīng)。Dig標(biāo)記的探針：+原位核酸分子，+與酶或熒光素偶聯(lián)的地高辛抗體→特別是在檢測內(nèi)源性生物素高的腸道系統(tǒng)時采用免疫酶學(xué)檢測方法Dig–HRP檢測體系：以DAB/H2O2為底物，結(jié)果為棕色；價廉、穩(wěn)定。Dig–AKP檢測體系：以BCIP/NBT為底物，結(jié)果為藍(lán)紫色；靈敏度和分辨率高。1.組織切片的預(yù)處理（1）固定：10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚5μm，粘附于涂有粘附劑的硅化玻片上，60℃烤片6-8h（2）脫蠟：二甲苯10min×2，梯度酒精入水，PBS5min×2（3）除蛋白：0.2mol/LHCl37℃20-30min，PBS5min×2（4）抑制核酸酶：50℃2×SSC30min(檸檬酸鈉),含5mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)組織切片的預(yù)處理（5）蛋白消化：100μg/ml蛋白酶K37℃20-25min（6）中止蛋白酶反應(yīng)：0.2%甘氨酸的PBS液中5min×2（7）再固定：4%多聚甲醛10-20min，PBS5min×2（8）脫水：梯度酒精，晾干地高辛標(biāo)記的DNA探針檢測石蠟切片病毒DNA2.預(yù)雜交：加預(yù)雜交液20μl/張切片，42℃30min3.雜交：加適量雜交液，蓋硅化蓋片，95℃10min，使探針及病毒DNA變性；置于冰上1min，2×SSC濕盒內(nèi)，37-42℃過夜

(可采用原位雜交儀進(jìn)行變性和雜交)

4.雜交后漂洗（1）2×SSC液內(nèi)振動移除蓋片，5-10min×2，0.5×SSC5-10min×2（2）加封阻緩沖液II

：37℃或室溫30min，緩沖液I15min（3）AKP標(biāo)記的Dig抗體：37℃30min，緩沖液I15min×2（4）AKP底物緩沖液III：2-5min地高辛標(biāo)記的DNA探針檢測石蠟切片病毒DNA5.顯色：（1）顯色液配制：緩沖液III加NBT和BCIP，37℃暗處顯色（2）終止反應(yīng)：緩沖液IV10min（3）核固紅復(fù)染5min，干燥脫水，DPX封片6.結(jié)果：陽性呈紫藍(lán)色，陰性→胞核呈紅色二、RNA原位核酸雜交RNA原位雜交組織化學(xué)或RNA原位雜交（一）基本原理：RNA原位雜交：運(yùn)用標(biāo)記的cRNA或寡核苷酸等探針檢測細(xì)胞和組織內(nèi)RNA表達(dá)的一種原位雜交技術(shù)基本原理基本原理：用標(biāo)記的已知核苷酸片段，按堿基配對原則，與待測細(xì)胞或組織中相應(yīng)的RNA片段結(jié)合，所形成的雜交體經(jīng)顯色反應(yīng)后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的mRNA、rRNA或tRNA分子應(yīng)用：已遠(yuǎn)超出DNA原位雜交，為最有效的分子病理學(xué)技術(shù)，特別適合分析低豐度和罕見mRNA的表達(dá)RNA與DNA原位雜交的主要區(qū)別點①使用的探針不同：RNA→RNA或寡核苷酸探針，可避免雙鏈DNA探針雜交中的復(fù)性和第二條鏈的競爭性雜交②雜交體不同：cRNA-RNA比DNA-DNA、cDNA-RNA性能穩(wěn)定，特異性更強(qiáng)③檢測的目的不同：RNA→內(nèi)源性和外源性基因，內(nèi)源性基因包括細(xì)胞內(nèi)固有、異常和變異基因。DNA→外源性基因，以獲得病原學(xué)診斷④靈敏度不同：RNA比DNA原位雜交能獲得更好的低拷貝核苷酸的定位（二）RNA原位雜交中的探針探針的種類：RNA探針：帶有標(biāo)記的能與組織內(nèi)相對應(yīng)的RNA核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合的一段單鏈cDNA或cRNA分子（1）單鏈cDNA探針：cDNA：是由RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化產(chǎn)生的，該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA?？寺r，可選擇不同的載體來控制cDNA是雙鏈還是單鏈。質(zhì)?！p鏈；M13衍生載體→單鏈優(yōu)點不存在內(nèi)含子不存在高度重復(fù)序列不需要變性克服了雙鏈DNA探針兩條鏈之間復(fù)性的缺點可提高探針濃度不形成大的鏈狀連環(huán)使探針難于滲入細(xì)胞內(nèi)較為理想（2）cRNA探針是以cDNA為模板在體外轉(zhuǎn)錄而成的探針，可通過克隆于質(zhì)粒載體產(chǎn)生改變cDNA插入方向或選用不同的RNA聚合酶→同義或反義RNA探針→cRNA探針經(jīng)過體外轉(zhuǎn)錄能得到標(biāo)記的cRNA探針→長度比較一致cRNA探針優(yōu)點：可避免應(yīng)用雙鏈cDNA探針時存在的兩條鏈之間的復(fù)性cRNA和mRNA的雜交體要比cDNA-mRNA雜交體穩(wěn)定，不受RNA酶的影響雜交飽和水平比雙鏈DNA探針高8倍缺點：制備復(fù)雜需要較好的設(shè)備易被RNA酶破壞（3）寡核苷酸探針指以核苷酸為原料，在體外人工合成的單鏈DNA片段均由DNA合成儀合成優(yōu)點避免高度重復(fù)序列的不利影響制備簡易：不需要復(fù)雜的實驗條件，不需要純化組織穿透性好：不長，單鏈特異性較強(qiáng)：可按照目的基因合成特異性核苷酸探針雜交時間短使用簡便：對RNA酶不敏感；不需預(yù)先加熱解鏈缺點長度必須適宜：太長可造成內(nèi)部錯誤雜交；太短可形成非特異性結(jié)合與mRNA的雜交不如RNA-RNA雜交穩(wěn)定敏感性較低：只能用末端標(biāo)記法標(biāo)記，結(jié)合的標(biāo)記物較少設(shè)計靶DNA或mRNA的序列已知→容易確定；僅知道氨基酸序列→選擇密碼簡并性最小的氨基酸序列原則：長度一般為30～50堿基(G＋C)含量應(yīng)在40～60％分子內(nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)2.探針的標(biāo)記①酶反應(yīng)法；②化學(xué)反應(yīng)法（1）末端標(biāo)記法：是將標(biāo)記物導(dǎo)入線型DNA或RNA的5，末端或3，末端的一類標(biāo)記法，主要用于寡核苷酸探針或短的DNA或RNA探針的標(biāo)記（2）體外轉(zhuǎn)錄法轉(zhuǎn)錄組分包括：純化的噬菌體RNA聚合酶、含噬菌體RNA聚合酶啟動子的DNA模板、標(biāo)記的三磷酸核苷酸噬菌體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄僅需一個“最小”的機(jī)構(gòu)非線型模板→

限制性內(nèi)切酶線化模板通過RNA聚合酶SP6、T7或T3，將地高辛標(biāo)記于RNA探針上。地高辛與UTP之間的鍵合對堿不敏感→

堿處理探針標(biāo)記法直接標(biāo)記法：探針與組織細(xì)胞內(nèi)靶核酸所形成的雜交體可直接顯示，對低拷貝的靶序列檢測不理想間接標(biāo)記法：用半抗原標(biāo)記探針，通過免疫組織化學(xué)或親和組織化學(xué)反應(yīng)對半抗原定位，間接顯示雜交體→最常用直接法原位雜交示意圖間接法原位雜交示意圖3.探針的純化探針標(biāo)記反應(yīng)液中存在游離的dNTP或磷酸鹽分子等→方法：乙醇沉淀法：無水乙醇可以沉淀DNA，而dNTP等小分子物質(zhì)和蛋白質(zhì)分子則留在上清液中→操作簡便探針的純化酚/氯仿抽提法：交替使用酚和氯仿。酚使蛋白質(zhì)變性；氯仿能使液體分層，不但能使蛋白質(zhì)變性，還能去除色素和蔗糖?？梢砸淮纬樘岫嗔緿NA。但是步驟相對繁雜，時間長，效率低，酚和氯仿具有揮發(fā)毒性純化試劑盒：不含有機(jī)溶劑和劇毒藥品，也不需特殊實驗條件，時間短，提取的DNA的純度和效率較高，但一次抽提DNA的量相對較少

4.雜交前準(zhǔn)備防止RNA酶的污染（1）載玻片和蓋玻片的處理：鋁箔紙包裹，180℃烘烤4-6h戴一次性手套及口罩（2）新鮮標(biāo)本的儲存和冰凍切片的制備：容器、刀具等經(jīng)高壓消毒或0.1%

DEPC（焦炭酸二乙酯）水清洗標(biāo)本投入4%多聚甲醛溶液內(nèi)4℃2-4h，15%、30%蔗糖PBS溶液內(nèi)4℃過夜標(biāo)本或切片儲存于超低溫冰箱內(nèi)（3）標(biāo)本的固定和石蠟切片的制備沉淀固定劑：醇和酮類，組織通透性較好，但固定時間過長可引起RNA降解，易引起組織形態(tài)改變交聯(lián)固定劑：醛類，能較好的保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但固定時間過長，可形成交聯(lián)，阻礙雜交體形成

5.雜交前探針的選擇應(yīng)與靶序列以外的核酸序列無同源性（1）RNA探針：50-150堿基；500堿基→約20h；超過500堿基→

堿基水解法；模板的長度盡可能接近探針長度（2）探針的濃度：①應(yīng)超過靶序列的濃度，最佳濃度是達(dá)到靶核酸最大飽和度的最低濃度；②放射性標(biāo)記探針濃度為0.5ng/μl，而非放射性標(biāo)記為1.0ng/μl；③雜交液的量每張切片30-50μl；④保持雜交液不流失→玻片的清潔必須徹底，應(yīng)用雜交罩等6.雜交的溫度和時間可增加甲酰胺濃度來降低Tm黑暗中雜交孵育過夜（三）RNA原位雜交的其他注意事項cRNA探針檢測組織切片中的RNA：①同一容器中不能同時放入含不同探針的切片②背景較深，可在52℃用含5%甲酰胺的2×SSC洗脫③顯色液中加入左旋咪唑，可減少內(nèi)源性堿性磷酸酶活性④堿性磷酸酶染色后不能經(jīng)過酒精和二甲苯2.用寡核苷酸探針檢測組織切片中的RNA①雜交溫度比Tm低5-10℃。短于18個核苷酸時，雜交溫度=2×(A+T)+4×(G+C)-5；大于36堿基，37-42℃②雜交后必須盡快漂洗③雜交液中加入變性剪切的鮭魚精子DNA，用前須在沸水浴中10min；還加有大分子化合物，如小牛血清白蛋白，聚乙烯吡咯烷酮和硫酸葡聚糖，也能封閉非特異的DNA結(jié)合位點第四節(jié)熒光原位雜交技術(shù)及其應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)(florescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)：是一種利用熒光信號對原位雜交樣本進(jìn)行檢測的技術(shù)。它將熒光信號的高靈敏度、安全性及直觀性和原位雜交的高特異性結(jié)合起來，通過熒光標(biāo)記的核酸探針與待測樣本核酸進(jìn)行原位雜交，在熒光顯微鏡下對熒光信號進(jìn)行辨別和計數(shù)，從而對染色體或基因異常的細(xì)胞和組織樣本進(jìn)行檢測和診斷，為各種基因相關(guān)疾病的分型、預(yù)前和預(yù)后提供準(zhǔn)確的依據(jù)發(fā)展1986年，Dilla等首次用熒光素直接標(biāo)記DNA探針檢測人染色體Pinkel等用生物素標(biāo)記DNA探針，建立了間接FISH地高辛和二硝基苯酚等標(biāo)記物以及各種不同顏色熒光素在FISH技術(shù)中被廣泛利用與PCR技術(shù)（提高了制備探針的能力和敏感性）、計算機(jī)圖像分析技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、染色體顯微切割等技術(shù)結(jié)合使用，用于細(xì)胞遺傳學(xué)、腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)、遺傳病基因診斷等研究中優(yōu)點操作簡單，探針標(biāo)記后穩(wěn)定方法敏感能迅速得到結(jié)果在同一標(biāo)本上可以同時檢測幾個不同的基因可以用于染色體分裂相、培養(yǎng)的間期細(xì)胞、組織的石蠟切片、冰凍切片等分類直接法：是用DNA片段作為探針，標(biāo)記上不同熒光素，在組織切片、間期細(xì)胞及染色體標(biāo)本上與靶核酸進(jìn)行DNA-DNA原位雜交。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素(FITC)、得克薩斯紅(Texasred)、Cy3、羅丹明及其衍生物四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRIT)、氨甲基香豆素醋酸酯（AMCA）等。該方法簡單快捷，但信號較弱間接法：用非熒光物質(zhì)標(biāo)記的探針，通過親和連接或免疫反應(yīng)帶入熒光物質(zhì)來檢測雜交體的存在，增加了雜交的敏感性實驗操作與用非熒光標(biāo)記探針的原位雜交基本相似用新鮮、冷凍組織、細(xì)胞涂片、培養(yǎng)細(xì)胞爬片及中期染色體等進(jìn)行FISH的結(jié)果優(yōu)于石蠟包埋組織的效果雜交前→變性處理注意熒光素對光和熱極為敏感→避光操作，環(huán)境溫度不能太高盡可能快地在熒光或激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照不觀察→密閉的盒內(nèi)保存在-20℃冰箱→5d應(yīng)用臨床：臨床細(xì)胞遺傳學(xué)、產(chǎn)前疾病診斷、腫瘤診斷、傳染性疾病的診斷、某些遺傳病基因攜帶者的檢測、生物學(xué)劑量測定研究：基因圖譜、基因表達(dá)、基因整組的進(jìn)化、腫瘤生物學(xué)、微生物學(xué)和病毒學(xué)、有絲分裂、減數(shù)分裂、復(fù)制時間、細(xì)胞分類及雜交瘤細(xì)胞分析以FISH為基礎(chǔ)的新技術(shù)分子遺傳學(xué)多色FISH：直接法：用多種具有可分辨光譜的熒光染料與不同的探針結(jié)合，在一個染色體中期分裂象或細(xì)胞核中可呈現(xiàn)多種顏色標(biāo)記間接法：采用三種或三種以上不同的標(biāo)記物，如生物素、地高辛和二硝基苯酚標(biāo)記探針，然后用不同顏色熒光素，如FITC(綠色)、羅丹明(紅色)和cascadeblue(藍(lán)色)標(biāo)記抗體進(jìn)行檢測，可在同一標(biāo)本上同時檢測多種DNA序列

纖維FISH技術(shù)是將細(xì)胞的全部DNA在玻片上制備出高度伸展的染色質(zhì)DNA纖維，然后用標(biāo)記不同顏色熒光物質(zhì)的探針與DNA纖維進(jìn)行雜交可以快速直接目視判斷探針位置以及多個探針間的相對位置、物理位置和重疊程度等，大大加速了基因定位和人類基因組高分辨物理圖譜的繪制

PRINS技術(shù)用引物引導(dǎo)的原位標(biāo)記（primedinsitulabeling,PRINS）基本原理：是PCR和FISH的結(jié)合。先由寡核苷酸引物或變性DNA片段與細(xì)胞內(nèi)的靶DNA互補(bǔ)序列復(fù)性；在聚合酶的作用下，將熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸(如FITC-11-dUTP)帶入新合成的DNA中可用于檢測罕見的異染色質(zhì)變異體和評價腫瘤細(xì)胞株的染色體異質(zhì)性1991年Hindkjaer和Koch等，用于在細(xì)胞或染色體原位檢測特異性DNA或RNA酶標(biāo)法檢測：用地高辛標(biāo)記，再用免疫組化顯色，普通光鏡觀察也適用于組織切片中DNA或RNA的檢測發(fā)展多色PRINS技術(shù)在同一染色體或細(xì)胞標(biāo)本上，連續(xù)進(jìn)行兩次或兩次以上的PRINS反應(yīng)，每次反應(yīng)采用不同的引物，并分別摻入不同的標(biāo)記物，通過顯色反應(yīng)，使不同的靶序列呈現(xiàn)出不同的顏色在基因定位、染色體物理框架圖的構(gòu)建方面應(yīng)用較廣應(yīng)用前景很高的快速性：重復(fù)序列DNA可在1h內(nèi)，單拷貝序列DNA可在3h內(nèi)得到結(jié)果高敏感性和特異性：PRINS是單次延伸，原位PCR為多次循環(huán)，因此PRINS可避免非特異性延伸和擴(kuò)增高穩(wěn)定性：引物引導(dǎo)作用、特異性片段的延伸和信號顯示高簡便性：不使用探針，只需要引物高推廣性：避免了熒光褪色和使用熒光顯微鏡的困難→

更廣闊的前景第五節(jié)人HER-2/neu基因的檢測HER-2基因：人類表皮生長因子受體2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,HER-2)基因，定位于染色體17q12-21.32上，具有酪氨酸激酶活性意義：超過30%的人類腫瘤存在HER-2基因的擴(kuò)增或過度表達(dá)(乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、涎腺腫瘤、胃癌和前列腺癌等)；20-30％的浸潤性乳腺癌有HER-2基因的擴(kuò)增

HER-2癌基因可抑制凋亡，促進(jìn)增殖；增加腫瘤細(xì)胞侵襲力；促進(jìn)腫瘤血管和淋巴管新生臨床應(yīng)用1998