方法學(xué)驗證的相關(guān)內(nèi)容學(xué)習(xí)

方法學(xué)驗證的相關(guān)內(nèi)容學(xué)習(xí)內(nèi)容提要：（方法學(xué)驗證的應(yīng)用、依據(jù)、類型、一般參數(shù)、要求）驗證應(yīng)用：方法驗證是對測定方法的評價，是建立新方法的研究內(nèi)容和依據(jù)。（新建方法、已建立方法的修訂驗證、已建方法的復(fù)現(xiàn)）驗證依據(jù)：方法應(yīng)用領(lǐng)域?qū)Ψ椒炞C要求的“指導(dǎo)原則”驗證類型：全部驗證Fallvalidation、部分驗證Partialvalidation、交叉驗證crossvalidationFullvalidation第一次新建方法；一個已建方法，但增加分析對象（精密、回收）。Partialvalidation（已建方法的部分改變）1） 分析方法改變（檢測器改變）；2） 生物樣品（抗凝劑改變）；3） 基質(zhì)改變（血一尿）；4） 前處理方法改變；5） 生物樣品種屬改變（rat大鼠一mouse小鼠）；6） 儀器改變工作軟件改變；7） 稀有生物樣品，取樣量有限。Crossvalidation樣品分析在不同場所或?qū)嶒炇疫M(jìn)行時，不同實驗室需進(jìn)行加樣生物樣品或?qū)嶋H樣品分析，建立實驗室間的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)。當(dāng)分析數(shù)據(jù)由不同檢測技術(shù)產(chǎn)生時LC-MSvsELSD需交叉驗證部分驗證：準(zhǔn)確度，精密度（都做）交叉驗證：加樣準(zhǔn)確度，實際樣品分析（任一）一般參數(shù)：精密度precision:同一勻質(zhì)樣品的一組測量值，彼此符合的程度。1） SD標(biāo)準(zhǔn)偏差standarddeviation2） %RSD相對標(biāo)準(zhǔn)偏差relativeSD，CV變異系數(shù)n>8標(biāo)準(zhǔn)差SD=開方（求和（xi—x均值）/（n-1））%RSD=SD/x均值X100%日內(nèi)精密度（intradayprecision）：同一次測定，7?10份，按方法做。測定，SD值，RSD限度（生物制品5%，藥品2%）。日間精密度（interdayprecision）：不同一次測定，7?10份，按方法做。測定，SD值，RSD限度（生物制品15%，藥品5%）。準(zhǔn)確性accuracy：結(jié)果與真值的接近程度，表示分析方法測定的正確性，通常用回收率實驗表示（加樣回收率）?；厥章?（測定液測定值一原樣液含測值）/加入量值X100%靈敏度：檢測限(limitofdetectionLOD)：分析方法能從背景信號中區(qū)分出藥物，所需樣品中藥物的最低濃度，LOD反映方法與儀器的靈敏度和噪音也表明樣品經(jīng)處理后本底值的高低。S/N>3定量限(limitofquantitationLOQ)在保證具有一定可靠性(一定準(zhǔn)確度和精密度)分析方法能夠測定出樣品中藥物的最低濃度。反映分析方法測定含藥物的低濃度樣品時的可靠性。選擇性(selectivity)：分析方法從其他成分中區(qū)分并定量目標(biāo)成分的能力專屬性(specificity)：指一種方法僅對一種分析成分產(chǎn)生唯一信號選擇性(selectivity)：指一種方法可對多種成分產(chǎn)生不同響應(yīng)，主要成分響應(yīng)可與其他成分區(qū)分選擇性的區(qū)分選擇內(nèi)容：化藥：雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、相關(guān)化合物、制劑輔料(可通過空白比較和添加法所得分析結(jié)果比較確定)體內(nèi)藥物：內(nèi)源性物質(zhì)、代謝物、分解產(chǎn)物、分析中的相伴物、內(nèi)源性代謝物體內(nèi)藥分的選擇性內(nèi)容：空白生物樣品(血尿、膽汁等、至少六個來源的生物樣品(非MS方法)、每個空白樣品均測定干擾和LOQ。線性(liner)：給定范圍內(nèi)獲取與樣品中供試物濃度成正比的試驗結(jié)果的能力線性范圍是指利用一種方法取得精密度、準(zhǔn)確度均符合要求的試驗結(jié)果，而且呈線性的供試物濃度的變化范圍其最大、最小量間的間隔。濃度范圍包括5-8個濃度點，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)覆蓋樣品濃度范圍。藥物一般80-120%(但低限不低于LOQ)體內(nèi)藥物、濃度上線高于樣品最高濃度，下限為LOQ相關(guān)系數(shù)(r)表示了線性度r30.9900重現(xiàn)性(Repeatibility)相同方法在正常條件下多次重復(fù)測定同一勻質(zhì)樣品所得分析結(jié)果的重現(xiàn)程度。穩(wěn)定性(Stability)生物樣品中藥物的穩(wěn)定性涉及儲存條件、藥物理化性質(zhì)、基質(zhì)、容器系統(tǒng)。Stability評價包括：樣品收集與前處理、短期儲存、長期儲存、凍融、處理后穩(wěn)定性。穩(wěn)定性試驗要求Stability考察條件應(yīng)反映實際測定過程的實驗條件。應(yīng)包括Stockingsolution穩(wěn)定性的考察凍融穩(wěn)定性至少高、中、低三個濃度、三個凍融過程在真實實驗條件下保存樣品，室溫化凍，至少保存24小時，第二、三次相同條件下至少保存12-24小時，在第三個circle時分析?！?如果樣品不穩(wěn)定，應(yīng)在-70°C下保存短期穩(wěn)定性：樣品化凍后室溫4-24小時考察穩(wěn)定性長期穩(wěn)定性：應(yīng)包括第一樣品—>最后樣品分析結(jié)束的全過程（三個濃度、足夠樣品）處理后穩(wěn)定性分析過程???一個方法經(jīng)建立、驗證、正常應(yīng)用后進(jìn)行分析。分析包括：標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、分析法與過程建立、驗證后方法應(yīng)用與建立分析結(jié)果認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)。藥物定量方法：LC、GC、生化免疫、同位素標(biāo)示。驗證要求：標(biāo)準(zhǔn)曲線至少6個點，包括LLOQ（標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度）、ULOQ（最高濃度）Upperlimitofquantification精密度precision和準(zhǔn)確度accuracy:三個濃度，每個濃度進(jìn)樣5次，測定與理論差<15%、LLOQ外<20%o三個濃度的分布要求:lowQCsample=3*LLOQmiddleQC=中間點highQC接近曲線最高點穩(wěn)定性：2個濃度的三次凍融（每個2次？） 生物樣品的室溫穩(wěn)定性、處理后的穩(wěn)定性。分析數(shù)據(jù)的可接受標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線除LLOQ,CV在15%以內(nèi)QCsample在分析過程中合理分布QCsample至少67%--> <15%最多33%--> >15%可接受每樣品周期中QC樣品至少5%中藥指紋圖譜方法驗證評價標(biāo)準(zhǔn) CSV圖譜？參數(shù)：精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性方法：相似度軟件要求：相似度>0.9or0.95建立實驗室的SOP標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程SOP標(biāo)準(zhǔn)操作作業(yè)書SOP內(nèi)容：原始記錄保存試劑安全儀器 樣品傳遞過程控制設(shè)備 樣品標(biāo)簽質(zhì)量控制 方法結(jié)果保證血清標(biāo)本保存的溫度和時間對熒光定量PCR檢測HBVDNA結(jié)果的影響,Pv0.01,f=1.60.尸>0.05o3討論HBVDNA定量檢測具有重要的臨床意義。①HBVDNA的定量陽性不僅可以輔助診斷血清HBsAg陽性的HBV的現(xiàn)癥感染，而且由于該檢查靈敏度高，不少HBsAg陰性的隱匿性HBV感染可據(jù)此發(fā)現(xiàn)。②與HBeAg比較HBVDNA的定量還可以更直接地了解病毒的復(fù)制水平，傳染性的大小，據(jù)此作者可以更科學(xué)選擇預(yù)防HBV傳播的方法和協(xié)助選擇治療方法。③在抗病毒治療過程中，通過對HBVDNA的定量的檢測可以了解藥物的療效。④動態(tài)追蹤急、慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA對于了解該病的自然史和發(fā)病機(jī)制等也具有重要意義。熒光定量PCR檢測HBVDNA目前在國內(nèi)開展較多，因為該方法具有敏感性高、線形范圍廣、檢測較競爭PCR等方法相對方便等優(yōu)點。采用本研究的試劑盒，其敏感度達(dá)5.0X10copies/ml，定量的線性范圍為：1X10。copies/ml至5X10copies/mll2【，2h左右可以出結(jié)果。目前多數(shù)醫(yī)院該項收費每份在150?200元，因此每天標(biāo)本來源有限，加之每次檢測均需要設(shè)置3管對照管及4管陽性參控品，不可能每天檢測。多數(shù)醫(yī)院的辦法是把標(biāo)本收集、離心后放置在4°C的條件下，每周檢測1次；又有研究表明體內(nèi)游離的病毒顆粒的半衰期僅為1.2dI，這更提示作者需要評價血清標(biāo)本在4C條件下保存7d對熒光定量PCRta測HBVDNA結(jié)果的影響。本研究顯示當(dāng)天檢測與4C條件下保存7d后檢測結(jié)果的符合率73.1%?62.5%，其相關(guān)系數(shù)為0.93,配對f檢驗比較兩組數(shù)據(jù)的均數(shù)的差異無顯著性意義。即在4C條件下保存7d，HBV的降解量對檢測結(jié)果的影響無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，對于標(biāo)本來源較少的單位，把標(biāo)本置于4。。條件下保存每周檢測1次是一種可行的方法，而不需嚴(yán)格規(guī)定2?8?C保存不超過72hI。最近Gessoni等的研究表明：4C條件下保存7d對HCVRNA的定量結(jié)果無影響。由于RNA比DNA更易于降解，因此本研究的結(jié)果是可以理解的。另外，需要注意：①體內(nèi)、體外的情況是不一樣的，盡管Nowak等研究表明體內(nèi)游離的病毒顆粒的半衰期僅為1.2d【3】，這與體內(nèi)存在的免疫清除，向體外排泄等因素有關(guān)。②對于標(biāo)本來源更少的單位，需要超過1周的時間檢測一次，在沒有確實可靠的資料前，提倡先把血清提取置于一20?C保存，直至檢測(根據(jù)操作指南不應(yīng)超過3個月)。如果由于條件的進(jìn)一步改進(jìn)，實驗問的差異進(jìn)一步減少，0.6對數(shù)單位作為允許誤差范圍不再合理時，本研究結(jié)果可能不再適用。③本研究也發(fā)現(xiàn)：盡管作者較嚴(yán)格地遵守PCR的操作規(guī)程及其他有關(guān)規(guī)定，兩次實驗問的符合率有待進(jìn)一步提高。［當(dāng)今分析儀器的自動系列集約化或條型碼的應(yīng)用，增加了系列化項目直接上機(jī)檢測量，但是由于過去采血后血液自然凝固，分離血清時間長影響了分析儀的多種功能的充分發(fā)揮，為了迅速推進(jìn)檢測技術(shù)的快速化，往采血管中添加分離膠、促凝劑縮短了血液凝時間。分離膠促凝采血管的應(yīng)用，是采血初級階段重要質(zhì)量控制，同時也制備了高品質(zhì)的血清標(biāo)本。原管直接上機(jī)檢測，減少了血清杯、試管的用量，規(guī)范了檢驗科采血技術(shù)，減少了多種多樣交叉感染機(jī)遇，從而保護(hù)了室內(nèi)外環(huán)境。但是，血清分離膠促凝采血管在夷踐應(yīng)用中，出現(xiàn)了涉及到分離膠、促凝劑的基礎(chǔ)理論及夷踐中規(guī)范化操作值得注意的有關(guān)問題。必須從基礎(chǔ)理論上去理解才能解決夷踐中出現(xiàn)的問題，本文就此討論如下。1973年美國PECTON公司、1982年日本積水化學(xué)工業(yè)的血清分離膠采血管投放市場，1993年中科院大速化物所和大速市臨床檢驗中心，在國內(nèi)首次研制出國產(chǎn)的血清分離膠，并受到衛(wèi)生部臨床檢驗中心的重視并參與規(guī)范化。1997年通過大速市科委鑒定，臨床應(yīng)用表明其性能己達(dá)到日本、美國的同類產(chǎn)品水平，其產(chǎn)品己投放國內(nèi)外市埸。分離膠分離血清、血塊的機(jī)理：血清分離膠由疏水有機(jī)化合物和硅石粉組成，具有觸變性的粘液膠體，其結(jié)構(gòu)中含有大量氫鍵，由于氫鍵的締合作用形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在離心力的作用下網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞變?yōu)檎扯鹊偷牧黧w，當(dāng)離心力消失后又重新形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種性質(zhì)被稱為觸變tt(thixotropy)。即在溫度不變的情況下，對這種粘液膠體施加一定的機(jī)械力，可從高粘度的凝膠狀態(tài)變?yōu)榈驼扯鹊娜苣z狀態(tài)，如果機(jī)械力消失又恢復(fù)原來高粘度的凝膠狀態(tài)。由機(jī)械力作用產(chǎn)生的凝膠和溶膠互變現(xiàn)象首先由Freundlich和Petrifi命名。為什么由機(jī)械力的作用會產(chǎn)生凝膠與溶膠的互變現(xiàn)象呢？觸變性是因為分離膠的結(jié)構(gòu)內(nèi)部含有大量氫^網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)之故。具體的說：氫^不僅形成單一的共價^,在一定條件下它還與其它負(fù)電荷的分子間形成一個弱氫^,在常溫下氫^比較轉(zhuǎn)容易被切斷引起再結(jié)合。硅石表面具有硅羥基(SiOH),形成SiO分子凝聚體(初級粒子)，在這種初級粒子間以氫鍵速結(jié)成^狀結(jié)合粒子。這種鏈狀硅石粒子與構(gòu)成分離膠的疏水有機(jī)化合物的粒子間更進(jìn)一步形成氫鍵而產(chǎn)生網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，構(gòu)成具有觸變的凝膠分子。分離膠比重維持在1.05，血清比重約1.02，血塊比重約1.08,當(dāng)分離膠與凝固后的血液在同一試管中離心時，由于對分離膠施加離心力而引起硅石凝聚體中的氫^網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞變成鏈狀結(jié)構(gòu)，分離膠就成為粘度低的物質(zhì)，比分離膠重的血塊就移到管的底部，分離膠發(fā)生返轉(zhuǎn)現(xiàn)象，形成管底部血塊/分離膠/血清三層。當(dāng)離心機(jī)停止轉(zhuǎn)動失去離心力后，分離膠中硅石凝聚體的^狀粒子間再次由氫鍵構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，恢復(fù)初始高粘度凝膠狀態(tài)，在血清中血塊間形成隔離血清分離膠促凝管和血漿分離膠抗凝管區(qū)別及用途：血清分離膠促凝管，主要應(yīng)用于批量標(biāo)本系列化項目檢驗，可原管直接上自動化分析儀。血漿分離膠抗凝采血管，主要應(yīng)用于急診生化、免疫項目系列化，用十化學(xué)分析儀檢測。采血混勻后可立即離心獲得血漿標(biāo)本。如何正確使用血清分離膠促凝采血管制備高品質(zhì)血清標(biāo)本？應(yīng)規(guī)范按下列圖解操作?，F(xiàn)今的分離膠采血管其原料為聚酯或聚丙烯。分離膠原料為聚烯烴、聚酯和丙烯。促凝劑為硅石粉、硅石炭素及蛇毒等噴徐于管壁.分離膠置于試管底部，注入血樣待血液凝固后置離心機(jī)中離心，分離膠即在血清、血塊之間形成隔離層。并使血清保持原狀，無改變。此隔離層緊密地粘附在試管璧上，可在原狀態(tài)下由自動分析儀直接吸取血清或冷藏保存，遠(yuǎn)途運(yùn)輸均不影響檢測結(jié)果，也避免了纖維蛋白析出和溶血的影響。此外，自血樣注入采血萱、血清分離、分析儀直取血清、血樣保存，廢棄物處理的全過程都在同一支管中進(jìn)行，避免血樣沾沾污操作者，防止血液中病毒的感染，減少了醫(yī)療廢物，提高了工作效率。所以，血清分離膠的應(yīng)用是醫(yī)學(xué)檢驗的一項重要發(fā)展。真空靜脈血液樣本的采集是對傳統(tǒng)采血方式的一次重大改進(jìn)。由于是在全封閉系統(tǒng)下完成采血程序，因而從根本上排除了血液污染和交叉感染的可能性；并且因其結(jié)構(gòu)簡單，使用方便，因而易于普及和推廣。但是，目前市場上真空采血管品牌眾多，如產(chǎn)品質(zhì)量欠佳可直接影響檢測結(jié)果。在這里筆者對影響真空采血管質(zhì)量的一些因素談?wù)勔娊?，不正之處請同行及用戶指正。真空采血管的硅化質(zhì)量用于試管內(nèi)壁處理的硅油有很多種類，有溶于水和不溶于水的，有溶于有機(jī)溶液和不溶于有機(jī)溶液的，粘度有極易流動的液體和半固態(tài)狀的液體。其間要選出適用于采血管內(nèi)壁處理，具有良好的化學(xué)惰性和生理惰性的硅油絕非一件易事。硅化處理較好的試管，內(nèi)壁應(yīng)該是非常光滑的。通過簡單的過水實驗，就能辨別試管內(nèi)壁處理的好壞。即將2毫升的水放入試管然后倒出，硅化處理好的試管內(nèi)壁是絕無分散的小水珠殘留在上面。那么可想而知，沒有血細(xì)胞掛壁現(xiàn)象的真空管已經(jīng)為分離出高品質(zhì)的血清打下了良好的基礎(chǔ)。2.EDTA-K2添加的均勻程度對血常規(guī)結(jié)果的影響由于玻璃管在安全性能上存有很大隱患，故目前使用特種塑料PET試管替代玻璃管成為一種趨勢。由于PET試管有著良好的疏水性，很大程度上加大了真空管的生產(chǎn)難度。眾所周知，當(dāng)在PET試管內(nèi)添加液體的EDTA-K2溶液時，由于PET試管的疏水性，一段時間后液態(tài)的EDTA-K2由于水分的部分流失，會在試管底部、管口或其他部位形成塊狀結(jié)晶，使其的溶解度大大的降低。大塊的EDTA-K2結(jié)晶由于不能在短時間內(nèi)充分與血液接觸并溶于血標(biāo)本，這樣就容易產(chǎn)生血小板聚集，白細(xì)胞分類結(jié)果不理想，甚至出現(xiàn)血標(biāo)本部分凝固等。我們知道，全血細(xì)胞分析所選用的EDTA-K2抗凝劑其最佳濃度為1.5?2.2mg/1ml全血。如EDTA-K2濃度太低，抗凝強(qiáng)度不夠，則出現(xiàn)血小板聚集現(xiàn)象；EDTA-K2濃度太高，尤其是有大塊的EDTA-K2結(jié)晶存在時，使局部的血細(xì)胞處于高滲狀態(tài)，此處細(xì)胞會出現(xiàn)暫時的收縮，這樣會導(dǎo)致白細(xì)胞分類結(jié)果不理想等。為了避免因水分流失而形成的結(jié)晶現(xiàn)象，一個理想的血常規(guī)真空采血管，EDTA-K2晶體應(yīng)該是非常細(xì)小均勻地分布在試管內(nèi)壁。這樣一旦血液進(jìn)入試管，均勻分布的EDTA-K2就能迅速地跟血液充分混勻，從而杜絕了血常規(guī)結(jié)果因真空采血管的原因而出現(xiàn)異常的現(xiàn)象。分離膠與促凝劑的應(yīng)用評價分離膠促凝管是醫(yī)院真空管使用最普遍的一種管子，但要做好這種管子也不容易。評價分離膠促凝管品質(zhì)好壞關(guān)鍵在以下幾個方面：①用同一份血液標(biāo)本，跟空白管做比對，某些離子含量是否會存在偏差。②將采集好含分離膠的血標(biāo)本管子放在水溫箱里，溫度調(diào)到38?39°C，待血標(biāo)本充分凝固后，離心，然后檢查血清中是否有油滴產(chǎn)生。由于油滴可對生化儀探針造成致命的堵塞，已有許多報道，關(guān)于這種現(xiàn)象的存在。③排除不正確的采血方法所造成的溶血因素，由于低劣的生產(chǎn)工藝，分離膠或促凝劑所殘留的有機(jī)溶劑是破壞血液標(biāo)本的元兇。這種破壞往往表現(xiàn)在標(biāo)本有較多的溶血現(xiàn)象，在血清中間漂浮著分離膠顆粒。另外值得一提的是包括國外真空管知名公司在內(nèi)都申明血凝管或促凝劑分離膠在采集血標(biāo)本放置半個小時后離心，這樣能很大程度上確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。防止真空采血管內(nèi)的液體霉變用于血凝和血沉的枸櫞酸鈉抗凝劑試管，生產(chǎn)時對環(huán)境及用于溶解的水要求相當(dāng)高。如果工藝和生產(chǎn)環(huán)境不當(dāng)，或所用的溶解水純度沒達(dá)到要求等，那么生產(chǎn)出來的產(chǎn)品在一段時間后試管內(nèi)的枸櫞酸鈉溶液就會有絮狀物產(chǎn)生（長霉菌），從而造成檢驗結(jié)果失真。由于PET管有很好的疏水性，此類管子非特殊包裝，建議在三個月內(nèi)用完。除以上所述之外，肝素管和草酸鉀/氟化鈉管由于相對用量較少，在技術(shù)上也沒有什么特殊之處，在這里就不一一敘述。另外值得一提的是真空管受海拔高度影響，故高海拔地區(qū)應(yīng)選擇高原型真空采血管。淺談?wù)婵詹裳芟嚓P(guān)知識2010-11-1115:44:551分類：工作I標(biāo)簽：I字號大中小訂閱.真空采血管在國內(nèi)外的歷史發(fā)展以及現(xiàn)狀：本世紀(jì)40年代初，真空采血技術(shù)被發(fā)明，它省略了抽拉針管和推血入試管等不必要的步驟，利用真空管中預(yù)先制造的真空自動吸血入管，很大程度上減少了溶血的可能。40年代美國BD公司率先推出商品真空型采血系統(tǒng)，其它醫(yī)療器械公司也先后推出自己的真空采血產(chǎn)品，至80年代，一種稱為安全管蓋（HEMOGARDTM）的全新管蓋問世。安全管蓋由套在真空管外的特殊塑料罩和新設(shè)計的橡膠管塞組成。二者結(jié)合在一起，減少了醫(yī)療工作者與管中內(nèi)容物接觸的可能，也減少了管蓋拔出后內(nèi)容物外濺的機(jī)會。塑料罩形成一個雙井形凹陷結(jié)構(gòu)，防止手指與管塞頂端及尾端殘留血液的接觸。這種帶有安全管蓋的真空采血管極大地減少了醫(yī)療工作者從采血到血樣處理的全過程中沾染血樣的可能，當(dāng)年安全管蓋榮獲全美最佳工業(yè)設(shè)計大獎。真空采血系統(tǒng)由于其干凈安全、簡單可靠的特點已在世界范圍內(nèi)被廣泛采用，并被NCCLS推薦，成為采血的標(biāo)準(zhǔn)器械。真空采血管90年代中期開始在我國部分醫(yī)院使用。目前，大多數(shù)大中城市中型以上的醫(yī)院已普遍接受了真空采血方式。作為臨床血液采集和檢測的新方式，真空采血器是對傳統(tǒng)采血、儲血方式的一場革命。真空采血系統(tǒng)主要由三部分構(gòu)成：（1）雙向無菌針頭：一端連接真空管，另一端進(jìn)行皮膚穿刺。由于雙向無菌針頭專為采血特別設(shè)計而成，與注射用針頭不同，針尖斜面成15度，表面特殊潤滑，更鋒利、進(jìn)針方便。一次靜脈穿刺后，可以抽取單個或多個血樣。（2）持針器：持針器內(nèi)徑13mm。配合規(guī)格統(tǒng)一的采血管使用，一端連接雙向針頭，另一端接真空管。持針器可以重復(fù)使用.（3）真空管：真空采血管標(biāo)準(zhǔn)直徑13mm，長75mm或100mm，由高質(zhì)量玻璃或塑料制成。雖然大小恒定，但由于管內(nèi)真空度不同，可以抽取不同體積。管內(nèi)含各種添加劑（抗凝劑和促凝劑等），無需自己配制、添加，減少了工序，方便、快捷；避免了自行配備添加劑的不準(zhǔn)確，并且可以滿足各種檢驗對血樣的要求新型PET材質(zhì)的真空采血管避免了玻璃試管破損后血液外溢的不安全。。真空采血管分類和制作原理目前醫(yī)院使用的真空采血管主要有以下幾個類別：無添加劑的干燥空管（白頭管）：采血管內(nèi)壁均勻涂有防止掛壁的藥劑（硅酮），避免血細(xì)胞附壁，防止離心時細(xì)胞破碎，釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)至細(xì)胞外，影響試驗結(jié)果。它利用血液自然凝固的原理使血液凝固，等血清自然析出后，離心使用。主要用于血清生化（肝功、腎功、心肌酶、淀粉酶等）、電解質(zhì)（血清鉀、鈉、氯、鈣、磷等）、甲狀腺功能、藥物檢測、艾滋病檢測、腫瘤標(biāo)志物、血清免疫學(xué)。促凝管（紅頭管）：采血管內(nèi)壁均勻涂有防止掛壁的硅酮，同時添加了促凝劑，如凝血酶、蛇毒、硅石粉、硅碳素、纖維蛋白酶等可使血液在10?30min凝固。促凝劑能激活纖維蛋白酶，使可溶性纖維蛋白變成不可溶性的纖維蛋白聚體，進(jìn)而形成穩(wěn)定的纖維蛋白凝塊，如果想快點出結(jié)果時，可采用促凝管。一般用于急診生化。含有分離膠及促凝劑的采血管（黃頭管）：管壁經(jīng)過硅化處理，并涂有促凝劑可加速血液的凝固，縮短檢驗時間。管內(nèi)加有惰性分離膠，惰性分離膠是一種聚合高分子材料不溶于水，具有抗氧化，耐高溫,抗低溫，高穩(wěn)定性之特性，比重約在1.04?1.05。血清的比重在1.026?1.031之間，紅細(xì)胞的比重在1.092?1.095之間。離心時，分離膠液化移到管中央，介于血清或血漿與血液有形成分之間,離心完畢后,固化形成屏障，使血清或血漿與細(xì)胞完全分離，保證了血清化學(xué)成分的穩(wěn)定，冷藏下48h無明顯改變。惰性分離膠管內(nèi)可加有肝素，可達(dá)到快速分離血漿的目的，樣本又可較長時間保存。分離膠與PET管具有很好的親和性，確實起到隔離作用。高品質(zhì)分離膠在離心后血清中不產(chǎn)生油滴，因此不會堵塞機(jī)器。主要用于血清生化（肝功、腎功、心肌酶、淀粉酶等）、電解質(zhì)（血清鉀、鈉、氯、鈣、磷等、甲狀腺功能、藥物檢測、艾滋病檢測、腫瘤標(biāo)志物、血清免疫學(xué)。管內(nèi)含有抗凝劑的采血管：1） 含有肝素鈉或肝素鋰的采血管（綠頭管）：肝素是一種含有硫酸基團(tuán)的粘多糖，分子量15000，因有硫酸基團(tuán)，帶有強(qiáng)大的負(fù)電荷，具有加強(qiáng)抗凝血酶滅活絲氨酸蛋白酶的作用，從而阻止凝血酶的形成，并有阻止血小板聚集等多種抗凝作用。肝素是一種極佳的抗凝劑，對血液成分干擾少，不影響紅細(xì)胞體積，不引起溶血，適用于做紅細(xì)胞滲透脆性試驗、血氣、血漿滲透量、紅細(xì)胞壓積、血沉及普通生化測定。因肝素具有抗凝血酶的作用，不適于做血凝試驗。過量的肝素會引起白細(xì)胞的聚集，不能用于白細(xì)胞計數(shù)，因其可使血片染色后背景呈淡藍(lán)色，故不適于做白細(xì)胞分類。由于肝素不能使離體后的血小板離散，成為單個顆?；蚣?xì)胞通過微孔，可造成血小板計數(shù)減低，白細(xì)胞計數(shù)及淋巴細(xì)胞計數(shù)偏高。商品肝素常含有磷酸鹽，可使無機(jī)磷測定偏高。肝素抗凝血應(yīng)于短時間內(nèi)使用，否則擱置過久血液又可凝固。2）含有乙二胺四乙酸（EDTA）以及其鹽的采血管（紫頭管）：乙二胺四乙酸是一種氨基多羧基酸，可以有效地鰲合血液中的鈣離子，鰲合鈣會將鈣從反應(yīng)點移走將阻止和終止內(nèi)源性或外源性凝血過程，從而防止血液凝固，與其他抗凝劑比較而言，其對血球的凝集及血細(xì)胞的形態(tài)影響較小，并且可以抑制血小板的聚集，適用于一般血液學(xué)檢驗。EDTA溶液pH與鹽類關(guān)系較大，低pH可使細(xì)胞膨脹。EDTA2K2可使紅細(xì)胞體積輕度脹大，采血后短時間內(nèi)平均血小板體積（MPV）非常不穩(wěn)定,半小時后趨于穩(wěn)定。EDTA2K2使鈣、鎂下降，同時使肌酸激酶（CK）、堿性磷酸酶（ALP）減低,因這些酶測定需要這些金屬離子；EDTA2K3的最佳濃度是1.5mg/ml，如果血少,EDTA濃度增高,中性粒細(xì)胞會腫脹分葉消失，血小板會腫脹、崩解,產(chǎn)生正常血小板大小的碎片，使分析結(jié)果產(chǎn)生錯誤。EDTA由于螯合鈣的作用強(qiáng)，使二磷酸腺苷（ADP）不能引起血小板聚集，另外EDTA能抑制或干涉纖維蛋白凝塊形成時纖維蛋白單體聚合,不適用于血凝及血小板功能檢查,亦不適用于鈣、鉀、鈉及含氮物質(zhì)測定。國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會（ICSH）推薦使用的抗凝劑是EDTA2K2,EDTA2Na2與EDTA2K2比較結(jié)果無明顯變化,但其溶解度低，抗凝速度慢，不適合末梢血的抗凝。EDTA抗凝的末梢血也宜15min后測定，否則血小板有暫時聚集使血小板假性減少，白細(xì)胞假性升高,直方圖異常。3） 含有檸檬酸鈉抗凝劑濃度為3.2%（0.109mol/L）的采血管（藍(lán)頭管）：檸檬酸鈉通過作用于血樣中鈣離子鰲合而起抗凝作用，大部分凝血試驗都可用枸櫞酸鈉抗凝，它有助于V因子和伽因子的穩(wěn)定。另外，用枸櫞酸鈉抗凝的血漿做活化部分凝血活酶時間（APTT）試驗，其對肝素的敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于草酸鹽抗凝血漿，當(dāng)APTT試驗用于監(jiān)控接受肝素治療的患者時，這一點顯得非常重要。枸櫞酸鈉6mg才能抗凝1ml血,堿性強(qiáng)，不適于血液化驗,亦不適于做生化檢測，枸櫞酸鈉對MPV及其他凝血因子影響極小，可用于血小板功能分析。血小板的聚集作用隨血漿中枸櫞酸鈉的濃度降低而增高，因此在貧血患者應(yīng)加入較正常人為多的抗凝劑。對于血液凝固試驗來講，如果血液比例過低,APTT時間會延長,凝血酶原時間（PT）結(jié)果亦會有顯著改變。PT測定,3.8%的抗凝劑比3.2%的國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）值高，其差別變化一般在0.7?2.7個INR單位之間。由于枸櫞酸鈉毒性小，也用于血液保存。同時枸櫞酸鈉在水中溶解慢，故只能配成水劑而不能用粉劑?？鼓齽┡c血比例為1：9時，主要用于纖溶系統(tǒng)（凝血酶原時間、凝血酶時間、活化部分凝血酶時間、纖維蛋白原）。采血時應(yīng)注意采足血量，以保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，采血后應(yīng)立即顛倒混勻5-8次。4） 含有檸檬酸鈉抗凝劑濃度為3.8%的采血管（黑頭管）:其抗凝劑與血液的體積比為1：4，一般用于血沉檢測，抗凝劑比例過于偏高時，血液被稀釋，可使血沉加快。5）管內(nèi)含有草酸鉀/氟化鈉（1份氟化鈉3份草酸鉀）（灰頭管）：草酸鉀是最常用的抗凝劑,優(yōu)點是溶解度大，與血液混合后可迅速與血中的鈣離子結(jié)合,形成不溶解的草酸鈣，使血液不凝固。常配成10%溶液,0.1ml（10mg）可使5ml血液不凝固。常用于血液生化測定，但不適于鉀、鈣的測定，草酸鉀還抑制乳酸脫氫酶（LDH）、ALP、淀粉酶（AMY）的活性。由于生成不溶性的草酸鈣沉淀,紅細(xì)胞會出現(xiàn)鋸齒狀，白細(xì)胞出現(xiàn)空泡,淋巴及單核會變形,不易做血片檢查。草酸可影響血液中某些成分的活性及與鈣形成的不溶性沉淀物可影響自動凝血儀測定時光電終點的觀察，所以草酸鉀很少用于血液學(xué)分析及血凝測定。而氟化鈉是一種弱效抗凝劑，濃度達(dá)6?10mg/ml血液才有抗凝作用,但它是血糖測定的優(yōu)良保存劑，使用時應(yīng)注意緩慢顛倒混勻，2mg/ml血液即能抑制糖分解。一般常同草酸鉀合并使用，其比例為氟化鈉1份,草酸鉀3份，此混合物4mg可使1ml血液在2?3d內(nèi)不凝固和抑制糖分解。一般用于血糖檢測，不能用于尿素酶法測定尿素，也不能用于檢測堿性磷酸酶和淀粉酶的檢測。因氟化物可激活尿素酶、淀粉酶。氟化鈉用量大時可造成溶血。自動化儀器的大量使用及血液的保存對血樣原始性狀穩(wěn)定性提出了更高的要求,使真空采血技術(shù)突破了僅僅只為安全的要求，而準(zhǔn)確性、標(biāo)本的原始性狀、維持時間及管機(jī)配合、試管強(qiáng)度等性能指標(biāo)都不能忽視，如何正確使用真空采血管以及真空采血管本身的優(yōu)劣都將影響標(biāo)本原始性狀及檢測的準(zhǔn)確性：一、 真空采血管的正確使用：1、將瓶塞穿刺針（不要將乳膠護(hù)套拔下）從采血管中心垂直刺入真空管內(nèi)，管中預(yù)設(shè)的真空將使所需要的血液流入管中，應(yīng)按管壁上的刻度值控制采血量；2、 當(dāng)?shù)谝还懿赏旰?，拔出瓶塞穿刺針再刺入另一真空管，如此重?fù)操作，可實現(xiàn)一針多管采血；3、 保證血液與管內(nèi)附加劑正確混合，采樣后立即輕輕倒置真空管五至八次。當(dāng)最后一管采樣完畢，將針頭抽離靜脈，管中的負(fù)壓可將管中殘存的約0.4ml的血吸入管內(nèi)。4、 多管采血順序：先抽普通（血清管），再抽速凝管，最后抽抗凝管。二、 真空采血管本身的優(yōu)劣（一）、相關(guān)材料的性能指標(biāo)空采血管的材質(zhì):現(xiàn)在采血管多為玻璃材料，普通玻璃的pH相差甚遠(yuǎn),溶血的可能性大大增加,而拉管工藝制作的玻璃試管線性溝密布，深淺粗細(xì)無常導(dǎo)致細(xì)胞的掛壁，相比較中性玻璃（藥用玻璃）的優(yōu)勢很明顯。中性玻璃具有耐壓，溶出物少，分子排列緊密,拉伸時溝槽少等優(yōu)點，但仍有表面負(fù)電荷過強(qiáng),pb2+、Zn2+、K+、Fe2+的相對溶出等缺點。這些都可能改變血液標(biāo)本的原始性狀，因此玻璃試管在使用前應(yīng)進(jìn)行無菌和內(nèi)壁處理。傳統(tǒng)的內(nèi)壁處理就是硅化，即將硅油分散在乙醚與乙醇中，涂覆管壁晾干或烘烤即成。由于硅油是一種惰性極強(qiáng)的混合物，不可能與玻璃表面發(fā)生任何性質(zhì)的化學(xué)作用,只是粘附在試管內(nèi)壁，牢度較低。另外硅油對預(yù)先加入的抗凝劑的有機(jī)酸根具有包覆作用，使試劑的絡(luò)合能力喪失，造成凝血。目前最好的處理方法為鉆60照射,去離子水沖洗，確保無菌、光滑、無異物,有效防止溶血。對無添加劑的采血管內(nèi)壁涂有硅酮，避免血細(xì)胞附壁,防止離心時細(xì)胞破碎。但從環(huán)保和安全性去考慮，塑料材料的真空采血管,質(zhì)輕便于運(yùn)輸，破損率小，用后可直接高壓滅菌或焚燒銷毀，將會是真空采血管材質(zhì)選擇的一個很大的趨勢。密封膠塞:密封膠塞的質(zhì)量直接影響到試管的真空性能及血液樣本的原始狀態(tài)，推薦使用丁基橡膠而不用天然橡膠。天然橡膠填料外滲嚴(yán)重，是一種可致溶血的材料，許多有機(jī)填料和助劑（包括石蠟油，硅油，柔軟劑，著色劑等）在真空狀態(tài)下會沿玻璃管壁往下爬，這類物質(zhì)尤其影響真空干燥的肝素類物質(zhì)的水溶性而導(dǎo)致凝血。另外其氣透性及水透性也不符合真空管的技術(shù)要求，真空丟失嚴(yán)重，管塞結(jié)合部可見塞屑粘壁嚴(yán)重。而丁基橡膠具有良好的塞封性能，溶出物大大減少,使得采血管即便是在101.3kPa的負(fù)壓時仍能在24個月內(nèi)保持真空恒定。真空恒定使采血對象即使有血壓及血液粘度的差別,以及采血環(huán)境溫度的變化仍能保持采血量的相對準(zhǔn)確，實際采血量誤差可控制在±5%以內(nèi)。誤差的來源主要是血液粘度的變化和操作偶然誤差，另一方面則是試管口徑的細(xì)微差別?，F(xiàn)代采血管多采用雙層管帽設(shè)計,在內(nèi)層涂有潤滑劑的橡膠軟塞外面套有紋面塑料管蓋，使開啟極為輕松，其側(cè)滑式的開啟方式可防止血液的飛濺。膠塞脊形的設(shè)計，使蓋更加牢固，蓋子頂部凹下部分可保證防止接觸血液標(biāo)本,減少對操作人員的血源污染。采用國際通用的頭蓋顏色標(biāo)記采血管用途,鮮明奪目，極易分辨，避免采血時用錯添加劑以及送檢樣本與檢測項目不符。3、試管的直徑:國標(biāo)試管的直徑是11.6?12.0mm，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗中的自動生化分析儀以及血液分析儀，大多為美國、日本產(chǎn)品,其樣品架內(nèi)卡直徑為13mm，國標(biāo)管顯然過小。直接上機(jī)后無法固定而程度不同的傾斜,偏離探針運(yùn)作時的軸心,探針被擊傷的可能性大大增加。而真空采血管多采用13（16）mmx75mm、13（16）mmx100mm的規(guī)格，適用于日立、貝克曼2庫爾特、東芝、奧林巴斯、島津、雅培、拜爾、羅氏、Dade2Bering、法瑪西亞等儀器直接上機(jī)使用。4、雙向采血針以及持針器:即靜脈穿刺針和管塞針，中間軟管連接,形成采血系統(tǒng)，一次進(jìn)針，多管采血。針頭切割邊緣，長度及角度采用電腦設(shè)計，專門應(yīng)用于靜脈穿刺,切割邊緣極為平滑，新型硅膠外膜，使患者的不適及采樣后遺留的疼痛感大大減輕。針管內(nèi)表面極度光滑,管壁最薄,采血速度快,細(xì)胞破損少。管塞針的止血護(hù)套在脫離膠塞時能永久封住針頭，護(hù)套回彈毋需時間積累，效率極高。護(hù)套防止疲勞時限應(yīng)超過24個月，該時限內(nèi)連續(xù)沖擊30次，回彈復(fù)位率應(yīng)達(dá)100%。持針器的設(shè)計多為靜脈穿刺和管塞穿刺針雙向直通式，采樣時只需換雙向針頭，可反復(fù)使用。BD公司的pronto持針器。采用卡環(huán)設(shè)計，采樣后只需輕按綠色卡環(huán)，即可卸下雙向采血針，快速簡便,與其配套的設(shè)計還有廢針丟棄盒,避免采血者被污染針頭所傷。北京創(chuàng)格公司的上插式（直角式）持針器，回血清晰,采血量易觀察不易穿透靜脈。奧地利greiner的偏心嘴管的持針架Holdex刺入靜脈角度好，使用方便。（二）、添加劑的正確使用由于血液分析的多樣性,添加劑包括多種成分，如抗凝劑、促凝劑、緩沖劑、保護(hù)劑、分離膠等。其品種、性能、濃度直接影響血樣的性狀和檢測結(jié)果。真空采血技術(shù)則在品種、濃度方面做到規(guī)范一致，并能長期維持其有效性，使添加劑對檢測結(jié)果的影響降到最小。真空采血管制作和使用過程中容易出現(xiàn)的問題雖然真空采血管由于其操作簡便、干凈安全、準(zhǔn)確可靠，正為各醫(yī)院普遍應(yīng)用。但在臨床使用過程中，時有各種問題發(fā)生，影響了標(biāo)本的順利采集。以下幾點是真空采血管使用中應(yīng)注意的幾個問題：取血時患者應(yīng)松弛，環(huán)境溫暖,防止靜脈攣縮。束膊時間不可過長，禁止拍打手臂，否則可造成局部血液濃縮或激活凝血系統(tǒng)。握拳2min后可使鉀的血清濃度增加1.0?1.5mmol/L。血液采集應(yīng)一針見血，以防止組織損傷，外源性凝血因子進(jìn)入試管，影響試驗結(jié)果。樣本采集血量要充足，真空的存在易使血球破裂，若使用不足血樣，采血后應(yīng)開啟瓶塞片刻。血液與抗凝劑的比例必須精確，抗凝劑在血標(biāo)本中的絕對含量可改變血漿中鈣離子濃度進(jìn)而影響實驗結(jié)果。鈣的絕對濃度越高,PT、APTT凝固時間越短。使用含促凝劑或分離膠的采血管時，一定要等血液凝固后再離心，否則血清中易出現(xiàn)凝塊而造成儀器堵孔。血清管（紅）一般要等0.5?1h,含促凝劑的要等10?30min，肝素管（綠）混勻后充分抗凝后即可離心分離血漿，分離膠管（黃）5?10min后離心。推薦的采血順序為凝血管（血清管）一枸櫞酸鈉管一肝素或EDTA管一草酸鉀2氟化鈉管f血沉管。主要原因是第一管內(nèi)往往含有組織液，易造成凝血，不適于做血凝測定。采血完畢后，先將最后一支試管抽離持針器，然后將針頭由靜脈拔出，如有漏血,除針頭安裝不嚴(yán)外，多見于止血保護(hù)套剝下或止血護(hù)套回彈過慢或不能回彈到位所致。6、 由于真空管的負(fù)壓相對較大，采血初始，血液流入管底速度快，紅細(xì)胞相互撞擊可致破裂，臨床偶見溶血。對此在采集血標(biāo)本時，傾斜雙向采血針采血管側(cè)針頭，使其靠近采血管側(cè)壁，血液沿管壁緩緩流下，避免紅細(xì)胞直接撞擊造成破裂，形成溶血。7、 由于雙向采血針采血管端乳膠護(hù)套松動或針頭刺出乳膠護(hù)套，至使雙向采血針密封不嚴(yán)。靜脈穿刺時，血液沿雙向采血針采血管端漏出。對此在采血前檢查并安緊乳膠護(hù)套，遇有針頭刺出則重新套好針頭，以保持其密閉性。8、 由于穿刺針頭貼于血管壁或采血管內(nèi)無負(fù)壓，而形成的血液流入不暢現(xiàn)象，可以在保證靜脈穿刺成功的前提下，調(diào)節(jié)針頭方向至血液流入采血管，若無效則更換采血管。9、 由于采血管內(nèi)負(fù)壓不足，而導(dǎo)致的采血量不足，可以將注射器針頭自采血管膠塞處刺入，抽吸采血管內(nèi)空氣使之形成負(fù)壓至采足血標(biāo)本。原有血容量較少時也可直接更換采血管。真空采血管的好壞對分析過程中起到如何重要的作用預(yù)置真空度，嚴(yán)格控制采血量：多數(shù)情況下，靜脈血樣的質(zhì)量取決于血液和抗凝劑的比例，但是使用針頭-注射器-試管采血，抗凝劑的配制、添加、采血的多少都很難嚴(yán)格控制，所以血液和抗凝劑的比例也很難準(zhǔn)確。血液和抗凝劑的比例過高或過低都會影響血樣的質(zhì)量。血液比例過高時，由于抗凝劑相對不足，血漿中出現(xiàn)微凝血塊的可能性增加。微凝血塊可能阻塞檢驗儀器，影響一些檢驗指