冷凍電子斷層成像的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢

冷凍電子斷層成像的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢

0膜蛋白結(jié)構(gòu)解析冷凍電視法和三維重建技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用迅速，已取得重要進(jìn)展。與X-射線晶體學(xué)和核磁共振波譜學(xué)(NMR)等傳統(tǒng)的測定蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)的方法相比較,它具有以下幾個方面的優(yōu)勢:1)保持生物樣品的活性和功能狀態(tài);2)無須制備晶體,特別適合難于結(jié)晶的大分子及其復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)判定;3)結(jié)合新型的電子顯微鏡、制樣機(jī)器人等設(shè)備和技術(shù),可以實現(xiàn)顯微制樣、數(shù)據(jù)收集、三維重構(gòu)全過程的自動化或半自動化,為高通量、快速解析大分子及其復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)打下基礎(chǔ)。利用冷凍電鏡技術(shù)進(jìn)行三維重構(gòu)的主要方法有:單顆粒分析(singleparticleanalysisSPA)方法,電子晶體學(xué)(electroncrystallography)方法,和電子斷層成像(electrontomography,ET)方法。其中電子晶體學(xué)方法較多用于一些膜蛋白結(jié)構(gòu)的解析,其解析的結(jié)構(gòu)可以達(dá)到很高的分辨率,但要得到蛋白的二維晶體仍然是一個非常具有挑戰(zhàn)性的工作。單顆粒分析方法適用于具有結(jié)構(gòu)同一性的樣品,通過采集大量單個顆粒的二維投影圖來重構(gòu)三維結(jié)構(gòu),是冷凍電鏡三維重構(gòu)發(fā)展最快也是最主要的結(jié)構(gòu)解析方法。利用單顆粒電鏡重構(gòu)技術(shù)已經(jīng)解析出了很多生物大分子、病毒以及復(fù)合物的結(jié)構(gòu),目前的最新研究成果已經(jīng)可以在準(zhǔn)原子或原子分辨率下解析具有高度對稱性的病毒分子結(jié)構(gòu),最高精度已經(jīng)達(dá)到約3.3魡左右。在準(zhǔn)原子分辨率下,許多結(jié)構(gòu)上的細(xì)節(jié)都清晰呈現(xiàn),并使得建立基于冷凍電鏡密度圖的獨立原子模型(denovomodelling)成為可能。對于不具有對稱性的大分子復(fù)合體,其結(jié)構(gòu)解析的分辨率也在迅速提高。另外,利用單顆粒分析方法解析各種重要功能的分子機(jī)器(molecularmachine)在不同功能狀態(tài)下的結(jié)構(gòu),以及利用其進(jìn)行重建結(jié)果的多變量統(tǒng)計分析以確定生物大分子復(fù)合物不同的構(gòu)象與結(jié)構(gòu)異性也是目前研究的熱點。電子斷層成像通過獲取同一區(qū)域多個角度的投影圖來反向重構(gòu)所研究對象的三維結(jié)構(gòu),適合于在納米級尺度上研究不具有結(jié)構(gòu)均一性的蛋白、病毒、細(xì)胞器以及它們之間組成的復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)。與蛋白質(zhì)電子晶體學(xué)和單顆粒技術(shù)相比,這種技術(shù)無需樣品顆粒具有結(jié)構(gòu)同一性,也不強(qiáng)調(diào)樣品具有一定的對稱性。因此,雖然目前電子斷層成像所獲得的結(jié)構(gòu)的分辨率(約4~10納米)不能與以上兩種技術(shù)相比,但其在研究非定形、不對稱和不具全同性的生物樣品的三維結(jié)構(gòu)和功能中有著不可替代的重要作用。冷凍電子斷層成像的適用尺度非常廣泛,包括從分子水平的蛋白質(zhì),到亞細(xì)胞水平的細(xì)胞器,以至細(xì)胞水平的組織結(jié)構(gòu)。它有效地填補(bǔ)了X-射線晶體學(xué)、核磁共振以及冷凍電鏡單顆粒分析等方法得到的高精度結(jié)構(gòu)和光學(xué)顯微鏡技術(shù)得到的低分辨率的細(xì)胞整體圖像之間的空白。同時,利用冷凍電子斷層成像法在獲得體外或細(xì)胞環(huán)境下大復(fù)合體或分子機(jī)器的納米精度的三維結(jié)構(gòu)后,嵌入組成這些大復(fù)合體或分子機(jī)器的各亞單元的通過X-射線晶體學(xué)、NMR或單顆粒分析等方法得到的原子分辨率結(jié)構(gòu),可以得到生理環(huán)境下重要分子機(jī)器在細(xì)胞環(huán)境中的三維空間分布以及組裝,從而為深入理解這些分子機(jī)器的相互作用機(jī)理提供重要而有益的信息。因此,電子斷層成像技術(shù)近年來在冷凍電鏡研究領(lǐng)域得到越來越多的關(guān)注,也被2002年《科學(xué)》雜志評為當(dāng)年的十大科技突破之一。1ct成像結(jié)合成像轉(zhuǎn)色法重構(gòu)三維結(jié)構(gòu)的圖像,根據(jù)樣品的結(jié)構(gòu)直接進(jìn)入三維斷層掃描技術(shù)(tomography)是從一個物體的投影圖像重構(gòu)獲得物體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的技術(shù),通過獲取同一物體的多個連續(xù)角度下的二維投影圖來反向重構(gòu)它的三維結(jié)構(gòu)。與醫(yī)院中使用的CT掃描類似,簡單地說,電子斷層掃描技術(shù)就是將一個物體(樣品)沿著一個與電子束垂直的軸旋轉(zhuǎn),每旋轉(zhuǎn)一個角度,采集這個物體在相對應(yīng)方向上的二維投影像,通過對這些二維投影圖的處理(相互配準(zhǔn)),將不同角度的二維投影圖反向重構(gòu)(如加權(quán)背投影等方法),獲得樣品整體三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)(圖1)。和CT成像轉(zhuǎn)動光源獲得不同角度的投影圖不同的是,ET的光源(電子束)不轉(zhuǎn)動,通過傾轉(zhuǎn)電子顯微鏡的樣品臺來得到所研究樣品的不同方向的投影。依據(jù)電鏡型號和樣品桿的不同,樣品傾轉(zhuǎn)范圍大概在±60~±80度之間。利用多角度投影的方法重構(gòu)物體的三維構(gòu)象的斷層掃描技術(shù)的理論基礎(chǔ)在幾十年前已經(jīng)建立。但早期的數(shù)據(jù)收集依靠人工完成,且需要處理的數(shù)據(jù)量相對于當(dāng)時的計算機(jī)處理能力而言也很龐大,因此相關(guān)工作的進(jìn)展較少。近年來,隨著計算機(jī)硬件的高速發(fā)展和數(shù)據(jù)處理能力的大大增強(qiáng),特別是電子顯微鏡的更新?lián)Q代以及斷層成像數(shù)據(jù)的自動收集硬件和軟件方面的改良,使得電子斷層成像研究,尤其是冷凍電子斷層成像研究,取得了極大的發(fā)展,也正在成為冷凍電鏡研究中一個越來越活躍的研究領(lǐng)域。1.1樣品制備1.1.1電子束的物理性質(zhì)和表面形貌,都可以采用化學(xué)方法進(jìn)行制樣和進(jìn)行樣品由于電子斷層成像較適合用于研究細(xì)胞環(huán)境下的三維結(jié)構(gòu),因此,很多的電子斷層成像的工作采用固定、包埋和切片的常規(guī)方法制備電鏡樣品。與CT掃描使用的X-射線相比,電子束能穿透的樣品厚度較小,限制了電子斷層掃描技術(shù)對大的生物樣品(如完整的真核細(xì)胞等)的研究。對電子束難以穿透的厚樣品,如細(xì)胞等,只能采用切片的方法進(jìn)行制樣。常規(guī)的制樣方法包括化學(xué)固定、樹脂包埋、切片和染色等步驟。為了研究整個細(xì)胞、組織等樣品,一般使用1%~5%戊二醛作為主固定劑,利用四氧化鋨等作進(jìn)一步固定后,在一系列梯度濃度的乙醇和丙酮中進(jìn)行脫水以減小迅速脫水引起的結(jié)構(gòu)變化。脫水后的樣品被轉(zhuǎn)移到樹脂中在60度左右進(jìn)行樹脂的聚合包埋,然后進(jìn)行系列切片(電子斷層成像樣品一般做成100~500nm厚度的切片),最后利用鞣酸和醋酸鈾等進(jìn)行染色,送入電鏡觀察和照相。1.1.2冷凍電子斷層成像對于一些電子束能穿透的較小或較薄的樣品,如病毒、細(xì)菌,以及一些小細(xì)胞等,可以采用與單顆粒分析制樣方法相同的快速冷凍(plunge-freezing)的方法準(zhǔn)備樣品并進(jìn)行冷凍電子斷層成像研究。冷凍電子斷層成像的主要優(yōu)勢是樣品接近于天然狀態(tài),克服了由于化學(xué)固定、脫水、冷凍替代和染色等帶來的可能的假象,很好地保護(hù)了生物樣品結(jié)構(gòu)的完整性。快速冷凍制樣法將保持在自然狀態(tài)緩沖液中的樣品加入覆蓋在電鏡銅網(wǎng)上的帶孔碳膜上,用濾紙吸去多余樣品,然后將樣品快速浸入處于液氮溫度環(huán)境的液態(tài)乙烷冷凍劑中。由于樣品層非常薄,冷卻速度很快(可達(dá)幾萬度/秒),樣品中的水會形成一種非晶態(tài)的冰,樣品分子即懸浮在這層玻璃態(tài)的冰中,保留了樣品的原始結(jié)構(gòu)信息及構(gòu)象狀態(tài),并在利用液氮保持低溫的條件下送入冷凍電鏡觀察。1.1.3不同冷凍方式制備的樣品由于水是熱的不良導(dǎo)體,對于大的樣品(如整個細(xì)胞),冷凍能達(dá)到的深度和體積是非常有限的。雖然常規(guī)的通過化學(xué)固定、樹脂包埋、切片、染色等步驟進(jìn)行制樣的方法對細(xì)胞和組織器官等的電子斷層成像也取得了許多很好的成果,但是制樣過程仍然會引起一些結(jié)構(gòu)畸變,影響了樣品的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。對厚樣品可以采用高壓冷凍(highpressurefreezing,利用高壓降低水的冰點使得冷凍達(dá)到更深的層次),隨后進(jìn)行冷凍替代(freezesubstitute,在低溫下用有機(jī)溶劑將冷凍組織進(jìn)行置換脫水),逐漸升溫后進(jìn)行傳統(tǒng)的包埋、切片等步驟進(jìn)行制樣。利用這種方法制備的樣品在結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)的保持上可以取得較好的效果。而真正能使大細(xì)胞和組織保持天然狀態(tài)的制樣辦法是高壓冷凍并進(jìn)行冷凍切片(cryo-sectioning)。但冷凍切片還是一項很具挑戰(zhàn)性的工作,目前只有少數(shù)的實驗室能夠達(dá)到較高的成功率。1.2電子故障圖像的三維重建過程1.2.1數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)電子斷層成像的數(shù)據(jù)收集從找到合適的成像區(qū)域開始。在起始位置成像后,樣品傾轉(zhuǎn)到下一個角度,對同一區(qū)域進(jìn)行成像。電子斷層成像的數(shù)據(jù)收集的大概過程如下:1)尋找(search)合適區(qū)域,一般在較低放大倍數(shù)下進(jìn)行;2)調(diào)節(jié)樣品臺傾轉(zhuǎn)中心高度(eucentricity),使樣品臺傾轉(zhuǎn)時樣品維持在成像中心范圍;3)調(diào)焦(focus);4)找到同一成像區(qū)域的精確跟蹤(tracking);5)照相(exposure);6)樣品傾斜到一個更高角度后,重新找到樣品的位置中心,然后重復(fù)以上四個模式,即search、focus、tracking、exposure幾個模式交替進(jìn)行。由于電子斷層方法需要對同一個區(qū)域反復(fù)成像,對樣品局部區(qū)域可能造成較大幅度的輻照損傷,因此必須嚴(yán)格控制樣品臺的精確傾轉(zhuǎn),保持對成像區(qū)域的自動跟蹤,以及控制每次成像的電子束劑量等。為了減少對成像區(qū)域的電子輻照損傷,一般利用lowdose模式的數(shù)據(jù)采集方案:即search模式采用較低的放大倍數(shù),而focus和tracking模式時的照相區(qū)域稍微偏離樣品中心exposure模式位置以減少對樣品的輻照。在數(shù)據(jù)收集過程中,對不同傾轉(zhuǎn)角度圖像的tracking是通過互相關(guān)運(yùn)算來完成的。為了提高圖像襯度和跟蹤的準(zhǔn)確性,可以在樣品中加入膠體金顆粒。樣品傾轉(zhuǎn)的角度范圍取決于樣品桿類型、銅網(wǎng)類型、感興趣區(qū)域在銅網(wǎng)處的位置和樣品的厚度。數(shù)據(jù)收集方式可以從0度角開始向兩端傾轉(zhuǎn),也可以從最大負(fù)面傾斜角度開始到最大的正面傾斜角。最常見的是記錄傾斜系列范圍在±60~±70度之間,采用1~3度間隔的線性步長。為了提高缺失錐(missingwedge)附近的采樣密度,可以增大高角度位置的采樣密度,如采用Saxton方案等。目前已有一些相對成熟的自動數(shù)據(jù)采集系統(tǒng),包括一些設(shè)備生產(chǎn)廠家提供的商業(yè)軟件,如FEI的Xplore3D,Titzs的EM-Menu等,以及一些實驗室開發(fā)的軟件如:SerialEM,UCSFTomo,TOM,Leginon等。這些程序通過控制顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng),樣品臺和CCD來自動記錄樣品在不同角度下的一系列圖像。隨著電鏡硬件以及軟件控制的日趨完善,可以在預(yù)先設(shè)定的想要照相的各個區(qū)域進(jìn)行斷層成像數(shù)據(jù)的批量收集(BatchTomo),大大提高了數(shù)據(jù)采集效率,使得高通量、全自動化的電鏡斷層成像數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的成為可能。1.2.2基于標(biāo)記點與互相關(guān)的圖像配準(zhǔn)電子斷層成像三維重構(gòu)要經(jīng)過兩個步驟,首先是不同角度的投影圖像的配準(zhǔn),其次是配準(zhǔn)后圖像的反向投影進(jìn)行tomogram的三維重建。對一個傾斜系列投影的圖像進(jìn)行配準(zhǔn)是獲得高質(zhì)量重構(gòu)的重要基礎(chǔ)。圖像配準(zhǔn)主要是計算傾轉(zhuǎn)過程中由于樣品臺等的移動使得圖像中心的移動;其次,還需對由于不完美的成像條件導(dǎo)致的傾轉(zhuǎn)角度,圖像自身的旋轉(zhuǎn)、扭曲以及放大倍數(shù)等進(jìn)行修正。這種修正將顯著提高三維重建的質(zhì)量。圖像配準(zhǔn)有兩種最常用的方法:即基于標(biāo)記點的方法與基于圖像互相關(guān)匹配的方法?；跇?biāo)記點的方法是在樣品制備過程中,摻入一定大小的膠體金作為標(biāo)記物,然后根據(jù)膠體金在不同角度二維投影圖中的位置對該角度投影圖的區(qū)域中心和傾轉(zhuǎn)軸取向進(jìn)行優(yōu)化,這種方法最常用的軟件是IMOD。有時候,金顆粒在不同角度傾轉(zhuǎn)圖像中會發(fā)生漂移,導(dǎo)致不能很好地配準(zhǔn)。如果不摻入膠體金作為標(biāo)記物,可以利用互相關(guān)分析來進(jìn)行不同角度的投影圖的配準(zhǔn)和優(yōu)化,其中比較常用的軟件有Protomo。除了IMOD和Protomo外,還有其他一些軟件用于圖像配準(zhǔn),如Spider、EM3D、XMIPP、TOM等以及FEI的Inspec3D等商業(yè)軟件。1.2.3其他重建方法電子斷層圖像的三維重構(gòu)是由所有配準(zhǔn)的傾轉(zhuǎn)投影圖重新反向投影到一個3D體積中形成的。最常用的方法是加權(quán)背投影(weightedbackprojection,WBP),將每個二維投影圖像背向其記錄時的傾斜角方向投影到三維空間中,所有背投影圖像在三維空間中疊加形成樣品的三維結(jié)構(gòu)。為了防止對低頻信號的過采樣,引入了一個權(quán)重濾波器進(jìn)行調(diào)節(jié)。其他的重建方法包括70年代早期發(fā)表的迭代重構(gòu)方法,如代數(shù)重建技術(shù)(algebraicreconstructiontechnique,ART)和聯(lián)合迭代重建技術(shù)(simultaneousiterativereconstructiontechnique,SIRT)等。迭代重構(gòu)方法基于一個前提:重構(gòu)樣品沿著投影角的反向投影應(yīng)該與原圖像一致。據(jù)此,通過此方法將原始投影圖和重構(gòu)的投影圖進(jìn)行循環(huán)比較和優(yōu)化。迭代方法的一個優(yōu)勢是具有一致的權(quán)函數(shù),但計算量很大,得到三維重構(gòu)結(jié)果要花費(fèi)很長時間,GPU和并行處理算法的采用對此有所幫助。1.2.4異壓濾波一般來說,冷凍電子斷層成像中各個二維投影圖像的信噪比都比較低,因此重構(gòu)產(chǎn)生的cryo-tomograms的噪音也很大。所以對重建結(jié)果要進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕翟胩幚硪酝怀鲅芯繉ο?。常用的去噪處理方式包括中值濾波、非線性濾波等。其中,各項異性擴(kuò)散的非線性濾波方法用得比較多,如Tomoand等軟件。為了進(jìn)一步將對象從背景和噪聲中區(qū)分開,要對重建結(jié)果進(jìn)行分割(segmentation),以分開對象和背景。最簡單的方法是使用手動分割,它需要用戶繪制對象和背景的邊界輪廓。分割完成后可以利用表面渲染技術(shù)(surfacerendering)對tomogram進(jìn)行可視化。也有專門的軟件幫助進(jìn)行該過程,其中AMIRA軟件包是用的最多的,其它的如IMOD包中也提供該功能。以下維基百科網(wǎng)站收集了很多以上提到的電子斷層成像數(shù)據(jù)收集、處理以及其他冷凍電鏡成像處理中會使用到的軟件。(/wiki/Software_tools_for_molecular_microscopy)。2在細(xì)胞生物學(xué)和教學(xué)中的應(yīng)用顯微技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展歷史上起著極大的促進(jìn)作用。熒光顯微鏡和共焦顯微鏡為細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展提供了有效的途徑。近年來,綠色熒光蛋白家族以及超高分辨率的熒光顯微鏡,如PALM、STED等的發(fā)展為在細(xì)胞中定位一個特定蛋白或分子提供了非常強(qiáng)有力的工具,也為分子細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展提供了一個良好的工具。但這些光學(xué)成像工具仍然具有其局限性,比如只能一次定位少量蛋白的空間信息,空間分辨率也還有待提高。而電子斷層掃描技術(shù)可以對細(xì)胞體內(nèi)以及分離出來的細(xì)胞器進(jìn)行三維重構(gòu),并提供了在納米尺度范圍內(nèi)對細(xì)胞器環(huán)境下蛋白質(zhì)及分子機(jī)器的結(jié)構(gòu)進(jìn)行重構(gòu)的方法,對研究自然環(huán)境下各種分子機(jī)器的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、它們在細(xì)胞中的空間布局,以及精細(xì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)等具有重要意義。過去一些年間已經(jīng)利用電子斷層成像技術(shù)獲得了對于細(xì)胞生物學(xué)來說非常有價值的信息,比如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體;核孔復(fù)合物在細(xì)胞環(huán)境下的三維結(jié)構(gòu)信息等;細(xì)胞骨架在細(xì)胞中的三維分布;以及抗體在細(xì)胞中的傳遞等。對于一些小的不需切片的生物對象,可以用plunge-freezing方法獲得樣品以進(jìn)行冷凍電子斷層三維重構(gòu),這方面的研究有肌動蛋白、細(xì)菌和微管鞭毛等。病毒一直是冷凍電鏡的重要研究對象之一。過去的二十多年,冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)已經(jīng)為病毒結(jié)構(gòu)與功能研究提供了比較詳盡的資料,尤其是那些具有二十面體對稱性的病毒結(jié)構(gòu)。與單顆粒技術(shù)相比,電子斷層掃描技術(shù)的研究對象目前主要集中在不定形多態(tài)的、在生命過程中多變的并具有重要生物功能的病毒及其復(fù)合物,如皰疹病毒、艾滋病毒[18~22]等。雖然電子斷層掃描技術(shù)所獲得的分離的病毒粒子的結(jié)構(gòu)沒有單顆粒技術(shù)獲得的分辨率高,但它能解析一些沒有對稱性、在病毒生物功能中起重要作用的病毒的結(jié)構(gòu),兩種技術(shù)對病毒的結(jié)構(gòu)與功能研究都起著非常重要的作用。3冷凍電子斷層成像的硬件設(shè)備我國在電子顯微學(xué)研究方面具備很好的基礎(chǔ)和大量的積累,但高性能冷凍電子顯微設(shè)備的缺乏對冷凍電子顯微學(xué)的開展曾經(jīng)產(chǎn)生了很大的制約。受益于近年來國家對冷凍電子顯微學(xué)重要前景的重視和對科研投入的增多,目前國內(nèi)已經(jīng)擁有了包括2臺TitanKrios、1臺TecnaiF30等在內(nèi)的高端冷凍電子顯微鏡研究設(shè)備,其中一些單位也建成了一流的包括Vitrobot、高壓冷凍、冷凍切片等適合冷凍電子斷層成像研究開展的設(shè)施。同時,多家研究機(jī)構(gòu)也計劃或正在購置更多的冷凍電鏡設(shè)備。因此,中國已經(jīng)具備了很好的契機(jī)來開展冷凍電子顯微學(xué)和電子斷層成像方面的工作。冷凍電子斷層成像的快速發(fā)展是隨著近年來電鏡設(shè)備的改進(jìn),特別是可以自動控制樣品臺的傾斜并自動獲得相應(yīng)投影圖像的軟件系統(tǒng)而發(fā)展起來的。要進(jìn)行cryo電子斷層成像,電子顯微鏡需要滿足一定的要求,加速電壓一般要在200~400kV,最好裝有場發(fā)射槍(FEG)。試樣必須可以保持在低溫條件下(-196℃)在顯微鏡下觀察。同時,要有一個可傾轉(zhuǎn)的樣品臺,電鏡內(nèi)集成的可傾轉(zhuǎn)的冷凍樣品臺的穩(wěn)定性和傾斜性能比外插式的cryo-holders要好。為了自動收集電子斷層傾轉(zhuǎn)系列圖像,顯微鏡要配備一臺CCD和相應(yīng)的軟件控制系統(tǒng)。電鏡的光學(xué)系統(tǒng)和樣品臺的移動、樣品臺的傾轉(zhuǎn)、樣品中心成像區(qū)域的跟蹤以及成像時的調(diào)焦等都可以由相應(yīng)的軟件系統(tǒng)控制。斷層成像通常配備2k×2k或4k×4k的CCD相機(jī),最好能配備一個能量過濾器,可以研究更厚的冷凍樣品并過濾掉非線性彈性散射的電子提高成像質(zhì)量。4e-tilt雙軸傾轉(zhuǎn)和雙軸-n-ms的電子斷層成像技術(shù)冷凍電子顯微學(xué)和電子斷層成像依然是一個年輕的學(xué)科,處于發(fā)展和完善階段,無論在理論上還是實踐上都有許多工作要做。隨著設(shè)備的改進(jìn)和應(yīng)用的范圍的擴(kuò)大,冷凍電子斷層成像的全自動、高通量數(shù)據(jù)收集以及高效三維重構(gòu)也有更為迫切的需求。因此,探討和發(fā)展新的樣品制備、數(shù)據(jù)采集、圖像處理和三維重構(gòu)方法,將X-ray/NMR數(shù)據(jù)與電子斷層數(shù)據(jù)整合、擴(kuò)展數(shù)據(jù)范圍、提高結(jié)構(gòu)解析的分辨率,是電子斷層成像領(lǐng)域要解決的技術(shù)問題。1)采用更好的樣品制備方法(如高壓冷凍、冷凍替代、冷凍切片等)保持細(xì)胞或細(xì)胞器等樣品的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié);2)改進(jìn)數(shù)據(jù)收集方法、硬件及軟件,實現(xiàn)冷凍電子斷層成像的自動化、高通量數(shù)據(jù)收集。如利用Double-tilt雙軸傾轉(zhuǎn)減小缺失錐(missingwedge)效應(yīng);利用Batch-tomo方法高通量收集電子斷層成像數(shù)據(jù);提高加速電壓和采用能量