沉淀分離技術(shù)

沉淀分離技術(shù)第三章PrecipitationTechnology沉淀的目的通過沉淀達(dá)到濃縮的目的通過沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉積在固體中的非必要成分沉淀可以將已純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進(jìn)一步處理沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過程?！?.1沉淀法概述沉淀方法用于分離純化是有選擇性的，即有選擇地沉淀雜質(zhì)或有選擇地沉淀所需成分。生物分子在水中形成穩(wěn)定的溶液是有條件的，這些就是溶液的各種理化參數(shù)。任何能夠影響這些條件的因素都會(huì)破壞溶液的穩(wěn)定性。沉淀法就是采用適當(dāng)?shù)拇胧└淖內(nèi)芤旱睦砘瘏?shù)，控制溶液的各種成分的溶解度，從而將溶液中的欲提取的成分和其它成分分開的技術(shù)。AddYourTitleAddYourTitleAddYourTitle.加入沉淀劑沉淀劑的陳化促進(jìn)粒子生長(zhǎng)離心或過濾收集沉淀物沉淀法操作步驟：加沉淀劑的方式和陳化條件對(duì)產(chǎn)物的純度、收率和沉淀物的形狀都有很大影響沉淀能否發(fā)生沉淀劑或沉淀?xiàng)l件下對(duì)活性結(jié)構(gòu)是否有破壞作用沉淀劑是否容易除去沉淀劑是否對(duì)人體有害沉淀過程應(yīng)考慮的問題沉淀技術(shù)分離生化產(chǎn)物的典型例子是蛋白質(zhì)的分離提取

優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、原材料易得、便于小批量生產(chǎn)；

缺點(diǎn)：所得沉淀物可能聚集有多種物質(zhì)，或含有大量的鹽類，或包裹著溶劑，產(chǎn)品純度常比結(jié)晶法低，過濾也較困難。eg.從血漿中通過5步沉淀生產(chǎn)純度高達(dá)99%的免疫球蛋白和96%~99%的白蛋白。圖1利用蛋白質(zhì)沉淀大規(guī)模提純白蛋白與免疫球蛋白的工藝流程圖沉淀法分離蛋白質(zhì)的特點(diǎn)：生產(chǎn)前期可使原料液體體積很快減小10~50倍，從而簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)費(fèi)用；使中間產(chǎn)物保持在一個(gè)中性溫和的環(huán)境；可及早將目標(biāo)蛋白從其與蛋白水解酶混合液中分離出來，避免蛋白質(zhì)的降解，提高產(chǎn)物穩(wěn)定性；用蛋白質(zhì)沉淀法作為色譜分離的前處理技術(shù)，可使色譜分離使用的限制因素降低到最少?！?.2蛋白質(zhì)的溶解特性蛋白質(zhì)的溶解行為是一個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)，由其組成、構(gòu)象以及分子周圍的環(huán)境所決定。蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，所以其大部分是親水的，但其內(nèi)部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白質(zhì)比起在化學(xué)上類似的大分子蛋白質(zhì)更易溶解。蛋白質(zhì)是兩性高分子電解質(zhì)，主要由疏水性各不相同的20種氨基酸組成。親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的外表面。水分子在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內(nèi)部折疊的趨勢(shì)，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。疏水性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)大，疏水性強(qiáng)。蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構(gòu)成疏水區(qū)（憎水區(qū)）親水區(qū)荷電區(qū)蛋白質(zhì)性質(zhì)溶液性質(zhì)分子大小溶劑可利用度（如：水）氨基酸組成

pH值氨基酸序列離子強(qiáng)度可離子化的殘基數(shù)溫度極性/非極性殘基比率極性/非極性殘基分布氨基酸殘基的化學(xué)性質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)電性化學(xué)鍵性質(zhì)表1影響蛋白質(zhì)溶解度的參數(shù)水化層蛋白質(zhì)周圍的水化層可以使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液電荷蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障：§3.3蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離。因溶液是電中性的，水中應(yīng)有等當(dāng)量的反離子存在。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中反離子的電荷構(gòu)成雙電層。蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)分子靜電斥力范德華引力顆粒間的相互作用偶極力色散力誘導(dǎo)力顆粒間的相互作用的位能取決于離子強(qiáng)度在低離子強(qiáng)度時(shí)，顆粒距離處在中間狀態(tài)，雙電層斥力占優(yōu)勢(shì)，可看為一個(gè)凝聚的勢(shì)壘在高離子強(qiáng)度時(shí)，吸引力超過排斥力，相互間的總位能表現(xiàn)為吸引位能DLVO理論高離子強(qiáng)度低離子強(qiáng)度雖然這個(gè)理論所假定的條件并不完全適合于蛋白質(zhì)分子，但該理論對(duì)于理解破壞蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性仍有很大幫助，同時(shí)還有助于針對(duì)具體蛋白質(zhì)選擇最合適的沉淀劑及技術(shù)。DLVO理論顆粒間的相互作用的位能取決于離子強(qiáng)度。在低離子強(qiáng)度時(shí)，顆粒距離處在中間狀態(tài)，雙電層斥力占優(yōu)勢(shì)，可看為一個(gè)凝聚的勢(shì)壘；在高離子強(qiáng)度時(shí)，吸引力超過排斥力，相互間的總位能表現(xiàn)為吸引位能。雖然這個(gè)理論所假定的條件并不完全適合于蛋白質(zhì)分子，但該理論對(duì)于理解破壞蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性仍有很大幫助，同時(shí)還有助于針對(duì)具體蛋白質(zhì)選擇最合適的沉淀劑及技術(shù)。其他沉淀法金屬沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法非離子型聚合物沉淀法§3.4蛋白質(zhì)沉淀方法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法中性鹽鹽析法一、中性鹽沉淀法（鹽析法）鹽析：在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，產(chǎn)生沉淀的過程。1、鹽析的概念及過程概念缺點(diǎn)得到的樣品欲繼續(xù)純化，需花一定時(shí)間脫鹽優(yōu)點(diǎn)①成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備②操作簡(jiǎn)單、安全③對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用早在1859年，中性鹽鹽析法就被用于從血液中分離蛋白質(zhì)，隨后又在尿蛋白、血漿蛋白等的分離和分級(jí)中使用，得到了比較滿意的結(jié)果。鹽析鹽溶過程蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，容易互相吸引聚合沉淀。加入鹽離子后，破壞了吸引力，增加靜電斥力，使分子散開，溶解度增大？？？蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，分子中的－COOH、－NH2和－OH等親水基團(tuán)，與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周圍形成親水膠體，削弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力，蛋白質(zhì)分子表面極性基團(tuán)越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大。2、中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理水化膜電荷親水膠體在水中的穩(wěn)定因素

++++++++++++++++等點(diǎn)電時(shí)的蛋白質(zhì)（親水膠體）帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）脫水脫水脫水帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）不穩(wěn)定蛋白顆粒陰離子陽離子堿酸酸蛋白質(zhì)聚集沉淀帶正電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）堿++水化膜帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，使蛋白質(zhì)分子因熱運(yùn)動(dòng)碰撞聚集。（2）破壞水化膜，暴露出憎水區(qū)域,由于憎水區(qū)域間作用使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，憎水區(qū)域越多，越易沉淀。（3）中和電荷，減少靜電斥力，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，靜電斥力降導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。選用鹽析用鹽的幾點(diǎn)考慮： 鹽析作用要強(qiáng)鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經(jīng)濟(jì)3、中性鹽的選擇陰離子：

檸檬酸根-3>酒石酸根-3>F->I03->H2P04->S04->CH3C00->Cl->Cl03->Br->N03->Cl04->I->CNS-陽離子：

Th4+>Al3+>H+>Ba2+>Sr2+>Ca2+>Cs+>Rb+>NH4+>K+>Na+>Li+

Hofmeister對(duì)一系列離子沉淀蛋白質(zhì)的能力進(jìn)行排序，稱Hofmeister序列，或感膠離子序。常用于蛋白質(zhì)沉淀的鹽為硫酸銨和硫酸鈉。硫酸鈉雖無腐蝕性但低于400C就不易溶解，因此只適用于熱穩(wěn)定性較好的蛋白質(zhì)的沉淀過程。0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101（1）溶解度大（2）分離效果好（3）不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。（4）價(jià)格便宜，廢液不污染環(huán)境。最常用的鹽：硫酸銨緩沖能力弱，具腐蝕性，含N缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)（1）加入固體鹽法4、鹽析的操作方法適用：飽和度高，不增大溶液體積加入硫酸銨固體的量：查表、計(jì)算飽和度：

在給定條件下以可能達(dá)到的最大濃度的百分?jǐn)?shù)表示的鹽濃度。以硫酸銨為例：25℃時(shí)，硫酸銨的飽和溶解度是767g/L，定義為100%飽和度查表法查表時(shí)注意溫度不同量的硫酸銨溶解時(shí)會(huì)引起溶液體積的變化計(jì)算法20℃25℃g：每升溶液加入固體硫酸銨的質(zhì)量S2：所需達(dá)到的硫酸銨飽和度S1：原溶液的硫酸銨飽和度

（2）加入飽和溶液法適用：蛋白質(zhì)溶液體積不大，所需調(diào)整的硫酸銨濃度不高。V：所需加入的飽和硫酸銨溶液的體積；V0：原溶液體積；S2：所需達(dá)到的硫酸銨飽和度；S1：原溶液的硫酸銨飽和度。飽和硫酸銨的配制方法在一定量的水中加入過量的硫酸銨，加熱至50－60℃，趁熱濾去沉淀，再在0℃或室溫平衡1－2天，有固體析出時(shí)達(dá)100％飽和度。優(yōu)點(diǎn)硫酸銨濃度變化連續(xù)，鹽析效果較好。缺點(diǎn)硫酸銨飽和度的測(cè)定、計(jì)算工作手續(xù)繁瑣，而且透析袋容積有限、鹽析速度慢、硫酸銨耗費(fèi)大。（3）透析平衡法方法一：取料液分成等體積幾份，冷卻至0℃5、鹽析曲線的制作各級(jí)均離心分離沉淀物，將沉淀溶于2倍體積的緩沖液中，測(cè)定其中總蛋白和目標(biāo)蛋白濃度（或測(cè)定離心上清液）以飽和度為橫坐標(biāo)，沉淀（或上清液）中總蛋白和目標(biāo)蛋白濃度為縱坐標(biāo)，得到蛋白質(zhì)溶解度曲線蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力硫酸銨飽和度％蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力硫酸銨飽和度％方法二各級(jí)均離心分離沉淀物，將沉淀溶于2倍體積的緩沖液中，測(cè)定其中總蛋白和目標(biāo)蛋白濃度以飽和度為橫坐標(biāo)，總蛋白和目標(biāo)蛋白濃度為縱坐標(biāo)，得到蛋白質(zhì)溶解度曲線蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力硫酸銨飽和度％蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力硫酸銨飽和度％6、鹽析的影響因素（1）離子強(qiáng)度與離子類型S：離子強(qiáng)度為I時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度；S0：離子強(qiáng)度為0時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度；KS：鹽析常數(shù)。鹽析時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度與中性鹽的離子強(qiáng)度的關(guān)系：當(dāng)溶劑的溫度一定時(shí)，對(duì)于某一溶質(zhì)，S0是一常數(shù)，β（溶解度常數(shù)）

Cohn方程KS越大，有效成分溶解度隨鹽濃度增加而減小的程度越大。KS越大，分級(jí)范圍越小，鹽析效果越好。多價(jià)陰離子具有很高的KS，但高價(jià)陽離子的存在反而降低KS

；大而不規(guī)則的蛋白分子KS越大。KS主要取決于鹽的性質(zhì)：離子價(jià)數(shù)離子半徑介電常數(shù)KS幾種鹽的鹽析能力的排列次序：磷酸鉀>硫酸鈉>磷酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂1——纖維蛋白2——血紅蛋白3——擬球蛋白4——血清蛋白5——肌紅蛋白幾種蛋白鹽析時(shí)離子強(qiáng)度與溶解度的關(guān)系圖例3.1

溶菌酶在2.8mol/L和3.0mol/L硫酸銨溶液中的溶解度分別為1.2g/L和0.26g/L，試計(jì)算在3.5mol/L硫酸銨溶液中的溶解度。5.68×10-3g/L例3.2

有100L蛋白質(zhì)溶液，其中含牛血清蛋白BSA和另一種雜蛋白X，質(zhì)量濃度分別為10g/L和5g/L。擬用硫酸銨沉淀法處理該溶液以回收沉淀中的BSA。20℃下BSA和X的Cohn方程參數(shù)列于下表（假設(shè)其他蛋白質(zhì)的存在不影響方程參數(shù)），其中離子強(qiáng)度用硫酸銨濃度（mol/L）表示。（1）忽略溶液體積的變化，若回收90%的BSA，需要加入多少固體硫酸銨？（37.27Kg）（2）沉淀中BSA的純度是多少？（95.34%）蛋白質(zhì)βKsBSA21.67.65X20.06.85KS分段鹽析法Β分段鹽析法在一定pH、溫度條件下，改變離子強(qiáng)度。適用于早期粗提階段的分步分離。在一定離子強(qiáng)度下，改變pH、溫度。適于后期分離純化和精制。（2）蛋白質(zhì)濃度硫酸銨鹽析法測(cè)定羧基肌紅蛋白：蛋白質(zhì)濃度g/L硫酸銨飽和度%結(jié)果3058開始沉淀366開始沉淀306590%沉淀析出當(dāng)?shù)鞍诐舛仍黾?0倍時(shí)，鹽析時(shí)所需硫酸銨的飽和度約減小7%。適宜蛋白質(zhì)濃度是2.5％～3.0％（25mg/mL～30mg/mL）（3）pH的影響蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的溶解度就越大。改變pH值可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，因而就改變了蛋白質(zhì)的溶解度。遠(yuǎn)離等電點(diǎn)處溶解度大，在等電點(diǎn)處溶解度小，因此用中性鹽沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。在水或稀鹽溶液中測(cè)得的等電點(diǎn)與在高鹽溶液中測(cè)得的等電點(diǎn)結(jié)果可能不一樣注意（4）溫度的影響溫度是影響溶解度的重要因素，對(duì)于多數(shù)無機(jī)鹽和小分子有機(jī)物，溫度升高溶解度加大。但對(duì)于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強(qiáng)度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強(qiáng)度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨溫度升高而增加的。

在一般情況下，對(duì)蛋白質(zhì)鹽析的溫度要求不嚴(yán)格，可在室溫下進(jìn)行。但對(duì)于某些對(duì)溫度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力喪失。

1）注意飽和度表中規(guī)定的溫度；2）分段鹽析中，應(yīng)考慮每次分段后蛋白質(zhì)濃度的變化；3）鹽析后一般放置半小時(shí)至一小時(shí)，待沉淀完全后才過濾或離心；4）加入硫酸銨時(shí)應(yīng)注意攪拌，避免局部過濃；5）硫酸銨使用前須用H2S處理，高濃度的硫酸銨溶液使用前需用氨水或硫酸調(diào)節(jié)至所需pH。

7、注意事項(xiàng)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀法是基于不同蛋白質(zhì)離子具有不同等電點(diǎn)這一特性，依次改變?nèi)芤簆H值的辦法，將雜蛋白沉淀除去，最后獲得目標(biāo)產(chǎn)物。二、等電點(diǎn)沉淀法（1）適用于疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)（2）中性鹽濃度增大時(shí)，等電點(diǎn)向偏酸方向移動(dòng)，同時(shí)最低溶解度會(huì)有所增大。（3）無機(jī)酸通常價(jià)格便宜，無毒（4）蛋白質(zhì)對(duì)低pH敏感，易失活未沉淀蛋白質(zhì)的分率pH對(duì)大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響pH對(duì)白果堿提蛋白沉淀的影響利用等電點(diǎn)除雜蛋白時(shí)必須了解制備物對(duì)酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險(xiǎn)。不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，等電點(diǎn)會(huì)發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時(shí)，必須注意調(diào)整PH值。由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，效果不理想。主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白例如：工業(yè)上生產(chǎn)胰島素粗提液調(diào)PH8.0調(diào)PH3.0去除堿性蛋白質(zhì)去除酸性蛋白質(zhì)胰島素三、有機(jī)溶劑沉淀法許多能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低鹽濃度下沉淀蛋白質(zhì)。加入溶劑后會(huì)使水溶液的介電常數(shù)降低，而使蛋白質(zhì)分子間的靜電引力增大，導(dǎo)致凝集和沉淀。蛋白質(zhì)的溶劑化，使原來和蛋白質(zhì)結(jié)合的水被溶劑所取代，從而降低了它們的溶解度。有機(jī)溶劑可能破壞了蛋白質(zhì)的某種鍵如氫鍵，使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某種程度的變化，致使一些原來包在內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于表面并與有機(jī)溶劑的疏水基團(tuán)結(jié)合形成疏水層，從而使蛋白質(zhì)沉淀。機(jī)理分析進(jìn)展對(duì)某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。成本高。優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。②沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機(jī)溶劑）。2、有機(jī)溶劑的選擇和濃度的計(jì)算不同有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)的效率受多方面的影響，需通過試驗(yàn)加以選擇。大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次。

前提：能與水互溶V=需加入100％濃度有機(jī)溶劑的體積V0=原溶液體積S1=原溶液中有機(jī)溶劑的濃度S2=所要求達(dá)到的有機(jī)溶劑的濃度離子強(qiáng)度3、有機(jī)溶劑沉淀的影響因素溫度樣品濃度pH值有機(jī)溶劑必須預(yù)先冷至較低溫度，操作要在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑時(shí)必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，等電點(diǎn)附近通常溶液中鹽濃度以不超過5％為宜四、非離子多聚物沉淀法

20世紀(jì)60年代非離子型聚合物開始用于分離血纖維蛋白原和免疫球蛋白，從此高相對(duì)分子質(zhì)量非離子聚合物沉淀蛋白質(zhì)的方法被廣泛使用，如：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖等。①沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生共沉淀作用。②由于聚合物有較強(qiáng)的親水性，使生物大分子脫水而發(fā)生沉淀。③聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用形成復(fù)合物，在重力作用下形成沉淀析出。④通過空間位置排斥，使液體中生物大分子被迫擠聚在一起而發(fā)生沉淀。非離子多聚物沉淀蛋白的原理①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子。③沉淀后有機(jī)聚合物較難去除。特點(diǎn)：1）選用兩種水溶性非離子多聚物組成液液兩相體系，不等量分配，而造成分離。2）選用一種水溶性非離子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。方法聚電解質(zhì)是含有重復(fù)離子化基團(tuán)的水溶性聚合物，可用于蛋白質(zhì)沉淀的聚電解質(zhì)有聚丙烯酸、聚乙烯亞胺、羧甲基纖維素和離子型多糖如肝素等。沉淀機(jī)理五、聚電解質(zhì)沉淀法蛋白質(zhì)分子的相反電荷與聚電解質(zhì)結(jié)合，形成一個(gè)多分子絡(luò)合物，當(dāng)絡(luò)合物超過游離蛋白質(zhì)的溶解度極限值時(shí)，就發(fā)生沉淀。六、生成鹽復(fù)合物沉淀法金屬?gòu)?fù)合鹽法有機(jī)鹽法無機(jī)復(fù)合鹽法能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物強(qiáng)烈結(jié)合的金屬離子，如：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+；能與羧酸結(jié)合而不與含氮化合物結(jié)合的金屬離子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+；與巰基化合物強(qiáng)烈結(jié)合的金屬離子，如：Hg2+、Ag+、Pb2+。金屬離子沉淀蛋白質(zhì)可分為三類：實(shí)際使用時(shí)，金屬離子的濃度常為0.02mol/L。Zn2+沉淀尿激酶有機(jī)鹽法無機(jī)復(fù)合鹽法含氮有機(jī)酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出，沉淀后用乙醚除去有機(jī)酸。如細(xì)胞色素C用45%硫酸銨除雜后，用20%TCA即可將其沉淀。如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等?？杉尤胍颐鸦虿捎秒x子交換除去無機(jī)鹽。七、其他沉淀法1、選擇性變性法酸堿變性熱變性表面活性劑變性有機(jī)溶劑變性選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀下來，而與目的物分開，這種分離方法就稱為選擇性變性沉淀法。變性過程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)：用邊界條件（c=c0，t=0）積分得：c：蛋白質(zhì)濃度c0：蛋白質(zhì)初始濃度t：時(shí)間kD：變性速率常數(shù)，用阿累尼烏斯方程Z：頻率因子E：變性活化能R：氣體常數(shù)T：熱力學(xué)溫度例3.3

熱沉淀法處理兩種酵母脫氫酶A和B的混合液，A和B的熱變性速率常數(shù)分別為：試計(jì)算分別于20℃和50℃保溫10min后A和B的活性殘留率。2、親和沉淀利用蛋白質(zhì)與特定的生物或合成的分子之間高度專一的作用而設(shè)計(jì)出來的一種特殊選擇性的分離技術(shù)，其沉淀原理是依據(jù)“吸附”有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解度的大小。原理引導(dǎo)產(chǎn)生沉淀的方法有：離子交聯(lián)加入帶相反電荷的聚合物加入帶相反電荷的疏水基團(tuán)改變pH值，誘導(dǎo)產(chǎn)生疏水沉淀溫度誘導(dǎo)產(chǎn)生沉淀配基-載體復(fù)合物與目的蛋白質(zhì)的分離基本過程：親和結(jié)合洗滌初始階段：將一個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)與鍵合在可溶性載體上的親和配體絡(luò)合成沉淀；所得沉淀物用一種適當(dāng)?shù)木彌_溶液進(jìn)行洗滌，洗去可能存在的雜質(zhì)用一種適當(dāng)?shù)脑噭⒛繕?biāo)蛋白質(zhì)從配體中離解出來§3.4核酸的沉淀方法核酸分離純化應(yīng)維持在0-4℃的低溫條件下，以防止核酸的變性和降解。為防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羥基喹啉、檸檬酸鈉等以抑制核酸酶的活性。有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法鈣鹽沉淀法溶劑沉淀法常用的沉淀分離法有：1、有機(jī)溶劑沉淀法由于核酸都不溶于有機(jī)溶劑，所以可在核酸提取液中加入乙醇、異丙醇或2-乙氧基乙醇，使DNA或RNA沉淀下來。核酸沉淀的形狀與其相對(duì)分子質(zhì)量密切相關(guān)：相對(duì)分子質(zhì)量>106Da的雙鏈DNA可以絲狀纖維纏繞在玻棒上；相對(duì)分子質(zhì)量稍小的雙鏈DNA或單鏈DNA、RNA則以凝膠形式存在。這些核酸經(jīng)離心后存在于沉淀中，用70%乙醇洗滌，除去其它鹽和小分子物質(zhì)，干燥后即為核酸制品。2、等電點(diǎn)沉淀法脫氧核糖核蛋白的等電點(diǎn)為pH4.2；核糖核蛋白的等電點(diǎn)為pH2.0-2.5；tRNA的等電點(diǎn)為pH5。3、鈣鹽沉淀法核酸提取液10%氯化鈣鈣鹽形式1/5體積的乙醇DNA鈣鹽沉淀4、選擇性溶劑沉淀法①在核酸提取液中加入氯仿/異戊醇或氯仿/辛醇，振蕩一段時(shí)間，使蛋白質(zhì)在氯仿/水界面上形成凝膠狀沉淀而離心除去，核酸仍留在水溶液中。②在對(duì)氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，DNA和RNA都進(jìn)入水層，而蛋白質(zhì)沉淀于苯酚層中被分離除去。③在DNA與RNA的混合液中，用異丙醇選擇性地沉淀DNA而與留在溶液中的RNA分離。沉淀法應(yīng)用利用蛋白質(zhì)沉淀大規(guī)模提純蛋白與免疫球蛋白的工藝檸檬酸的生產(chǎn)萃取