酶的活力測定及分離提取完整版

酶的活力測定及分離提取一、酶活力的測定（一）活力（性）的表示方法（二）測定二、酶的分離提取一、酶活力的測定（一）活力（性）的表示方法１、活力——v

測定酶活力就是測定酶促反應(yīng)速度。

v

：單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量。 單位時間內(nèi)底物的消耗量。2、酶的活力單位（U）：一定條件下，單位時間內(nèi)催化一定量的底物起反應(yīng)所需的酶量。1個酶活力單位（U），是指在特定條件下，在1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾（μmol）底物的酶量或是轉(zhuǎn)化底物中1μmol的有關(guān)基團(tuán)的酶量。1972年國際生化協(xié)會酶學(xué)委員會推薦了一個新單位：Kat——1秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物的酶量。1Kat=6×107U為了方便起見，有時用習(xí)慣法表示，如GPT的King氏單位。即100ml血清與足量的丙氨酸、a－酮戊二酸在37℃保溫1h，每生成1umol丙酮酸為1個單位。α—淀粉酶可用每小時催化1克可溶性淀粉液化所需要的酶量來表示。3、酶的比活力單位質(zhì)量樣品中的酶活力。如：1mg蛋白質(zhì)中所含的U數(shù)。1Kg蛋白質(zhì)中所含的Kat數(shù)。比活力＝活力單位數(shù)(IU)蛋白質(zhì)（mg）比活力＝活力單位數(shù)(IU)酶制劑（g）可表示酶制劑的純度。在酶的提純過程中，隨著酶逐步被純化，其比活力也在逐步增加，比活力越高，表明E愈純，在酶的提純過程中，E的總活力數(shù)會減少，但比活力卻漸漸增加。4、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat

每秒鐘每個酶分子轉(zhuǎn)換底物的微摩爾數(shù)。

也即酶將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的效率。（二）測定要求：測定初速度 最適條件

[S]>>[E]活力測定常用方法：化學(xué)滴定法、比色法、比旋光度法、氣體測壓、測紫外吸收、同位素技術(shù)。二、酶的分離提取選材→細(xì)胞破碎→提取→純化→濃縮注意：防止蛋白質(zhì)變性。第五節(jié)影響酶促反應(yīng)速度的因素一、酶促反應(yīng)速度的測量二、酶濃度對υ的影響三、底物濃度的影響四、pH對υ的影響五、溫度對υ的影響六、激活劑對υ的影響七、抑制劑對υ的影響一、酶促反應(yīng)速度的測量酶促反應(yīng)速度可表示為：

①單位時間內(nèi)底物的消耗量

②單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量[t][P]0斜率=──=υd[P]d[t]酶反應(yīng)動力學(xué)主要研究酶催化的反應(yīng)速度以及影響反應(yīng)速度的各種因素。在探討各種因素對酶促反應(yīng)速度的影響時，通常測定其初始速度來代表酶促反應(yīng)速度，即底物轉(zhuǎn)化量<5%時的反應(yīng)速度。二、酶濃度對υ的影響反應(yīng)條件固定且[S]>>[E]下[E]V0υ=K[E]三、底物濃度對υ的影響（一）[S]對υ的影響（二）米氏方程（三）Km（一）[S]對υ的影響[S]V0ABCDpH、T、[E]固定?（二）米氏方程

Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說推導(dǎo)了能夠表示整個反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的公式，稱為米氏方程式。1、基礎(chǔ)

中間產(chǎn)物學(xué)說S+E

ES

P+E（1）S與E形成中間產(chǎn)物，且整個反應(yīng)速度取決于ES→P+E，即：V=K2[ES]（2）產(chǎn)物濃度P→0（初速度）

·[S]>>[E]

·反應(yīng)達(dá)到動態(tài)平衡（ES的生成=ES的消失）2、前提S+E

ES

P+EK1K-1K2K-2K-2忽略不計[S][Et]-[ES][ES]Km=K-1+K2K1=Vmax[S]Km+[S]V3、推導(dǎo)（1）[S]很小時[S]<<Km則

一級反應(yīng)（2）[S]很大[S]>>Km則V=Vmax

零級反應(yīng)（3）[S]處于Km附近時，

混級反應(yīng)V=VmaxKm[S]4、可用于判斷反應(yīng)級數(shù)V=Vmax[S]Km+[S]（三）米氏常數(shù)Km1、意義V=Vmax[S]Km+[S]當(dāng)V=—Vmax時1

2Km=[S]Km的物理意義：當(dāng)酶促反應(yīng)速度為最大速度一半時的底物濃度。幾種酶的Km值酶底物Km（mmol·

L-1）過氧化氫酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶磷酸己糖異構(gòu)酶蔗糖酶精氨酸-tRNA合成酶谷氨酸脫氫酶H2O26-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖

蔗糖（天然底物）棉籽糖

精氨酸t(yī)RNA（天然底物）谷氨酸α－酮戊二酸NAD+250.0580.7283200.0030.00040.122.00.025大多數(shù)酶的Km介于10-6~10-1mol·

L-1①Km為E的特征常數(shù)，在一定條件下為固定值。②Km與酶濃度無關(guān)，但與T、pH有關(guān)③Km可近似表示酶與底物的親和力，Km值越大，親和力越小。Km可用來判斷酶的最適底物。其他意義E+Sk+1k-1k+2ESE+Pk-1+k+2k+1Km=2、Km的求法——雙倒數(shù)作圖法V=Vmax[S]Km+[S]1

V=Km

Vmax1

[S]+1

Vmax與直線方程y=ax+b相當(dāng)雙倒數(shù)作圖法-1

Km1

V1

[S]1

Vmax四、pH對υ的影響

每一種酶只能在一定pH下才能表現(xiàn)酶反應(yīng)的最大速度，高于或低于此值，反應(yīng)速度都會下降，通常稱此pH值為酶反應(yīng)的最適pH值。pHV最適pH（1）一般酶最適pH4~8（2）植物5~6.5動物6.5~8（3）最適pH與等電點不一定一致。

如胃蛋白酶最適pH<pI

胰蛋白酶最適pH=pI

蔗糖酶最適pH>pI（4）酶的最適pH不是酶的特征性常數(shù)。（1）pH影響E結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，過酸、過堿會強(qiáng)烈影響酶蛋白的構(gòu)象，甚至使E變性失活。（2）pH影響E分子上某些基團(tuán)的解離狀態(tài)。（影響結(jié)合基團(tuán)、催化基團(tuán)的解離—酶活力降低影響活性中心構(gòu)象—影響酶專一性）（3）pH影響S分子某些基團(tuán)的解離狀態(tài)。酶有最適pH的原因五、溫度對反應(yīng)速度的影響一般來說，酶促反應(yīng)速度隨溫度的增高而加快。但當(dāng)溫度增加達(dá)到某一點后，由于酶蛋白的熱變性作用，反應(yīng)速度迅速下降，直到完全失活。酶促反應(yīng)速度隨溫度升高而達(dá)到一最大值時的溫度就稱為酶的最適溫度(optimumtemperature)。溫度對υ的影響V最適T·T升高，活化分子數(shù)增多,υ加快·T升高，酶蛋白變性,υ降低Q10溫度系數(shù)：T每增加10℃，υ增加的倍數(shù)。注意（1）動物體內(nèi)最適T一般30~50℃，植物40~60℃，有少數(shù)酶能耐較高的溫度，如某些細(xì)菌中分離的DNA聚合酶，最適溫度可達(dá)70℃，細(xì)菌淀粉酶在93℃下活力最大。（2）最適T，不是酶的特征常數(shù)，它與酶作用時間的長短、底物種類以及pH有關(guān)。（3）低溫時由于活化分子數(shù)目減少，反應(yīng)速度降低，但溫度升高后，酶活性又可恢復(fù)。六、激活劑對υ的影響

能夠促使酶促反應(yīng)速度加快的物質(zhì)稱為酶的激活劑。1、無機(jī)離子陰離子Cl－、Br－；陽離子H+

金屬離子（Zn2+、Cu2+、K+等）。2、中等大小的有機(jī)分子：GSH、Cys、VC、巰基乙醇、EDTA（乙二胺四乙酸）等。3、蛋白質(zhì)物質(zhì)。七、抑制劑對υ的影響（一）抑制作用的概念（二）不可逆抑制劑（三）可逆抑制劑（一）抑制作用的概念1、失活作用：凡使酶蛋白變性而引起酶活力喪失的作用。2、抑制作用：使酶活力下降，但并不引起酶蛋白變性的作用。（此作用使一部分酶的必需基團(tuán)或輔助因子失活（活力變?。?、抑制類型（1）不可逆抑制：I與E共價結(jié)合，是一不可逆反應(yīng)，二者結(jié)合后，不能透析除去抑制劑而恢復(fù)酶活力，稱為不可逆抑制作用。（2）可逆抑制：I與E非共價結(jié)合，為可逆反應(yīng)，透析能除去抑制劑使酶恢復(fù)活力，稱為可逆a抑制作用。[E]

無I可逆I不可逆I可逆與不可逆抑制劑的區(qū)別（一）[E]

[I]可逆與不可逆抑制劑的區(qū)別（二）[E]

[I]可逆I不可逆I（二）不可逆抑制劑I與E共價結(jié)合，是不可逆反應(yīng)，不能透析除去。常見不可逆抑制劑：烷化劑、酰化劑、氧化劑、有機(jī)磷、有機(jī)貢、氰化物、氮化物、重金屬。1、羥基酶抑制劑2、巰基酶抑制劑3）重金屬鹽類金屬離子Cu2+Hg2+Pb2+Ag+Fe3+等在高濃度時與酶蛋白結(jié)合成不溶性鹽而變性失活在低濃度時產(chǎn)生抑制作用4）氰化物、硫化物和CO與酶中的金屬離子形成較為穩(wěn)定的絡(luò)合物，使酶的活性受到抑制與細(xì)胞色素氧化酶的鐵卟啉結(jié)合，抑制呼吸作用5）青霉素抗菌青霉素與糖轉(zhuǎn)肽酶Ser－OH結(jié)合，使酶失活該酶催化細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖鏈的聚合，酶失活，細(xì)胞壁合成受阻，細(xì)菌生長受阻，青霉素起抗菌作用（三）可逆抑制劑I與E非共價結(jié)合，可透析除去。競爭性抑制劑——I與S結(jié)構(gòu)相似競爭與E的結(jié)合部位結(jié)合。非競爭性抑制劑——I與S結(jié)合在酶的不同部位。反競爭性抑制劑——E必須先與S結(jié)合，然后才與I結(jié)合競爭性抑制（competitiveinhibition）抑制劑與底物競爭與酶的同一活性中心結(jié)合，從而干擾了酶與底物的結(jié)合，使酶的催化活性降低，稱為競爭性抑制作用。酶的競爭性抑制反應(yīng)模式+IEIk+3k-3k+2E+SE+PESk+1k-1競爭性抑制的速度方程與圖形特征Vmax

KmKm'[S]Vmax/2KmVm[S]·=(1+[I]Ki）+[S]競爭性抑制的雙倒數(shù)方程競爭性抑制的雙倒數(shù)圖形特征⑴競爭性抑制劑往往是酶的底物類似物或反應(yīng)產(chǎn)物；⑵抑制劑與酶的結(jié)合部位與底物與酶的結(jié)合部位相同；⑶抑制劑濃度越大，則抑制作用越大；但增加底物濃度可使抑制程度減小；⑷動力學(xué)參數(shù)：Km值增大，Vm值不變。競爭性抑制劑的特點2.非競爭性抑制（noncompetitiveinhibition）抑制劑既可以與游離酶結(jié)合，也可以與ES復(fù)合物結(jié)合，使酶的催化活性降低，稱為非競爭性抑制。

k-3k+3+IESIk+2E+PESE+Sk+1k-1k-3k+3+IEI+Sk+1k-1反應(yīng)模式Vm[S]·=

(Km+[S])(1+[I]Ki）非競爭性抑制的速度方程非競爭性抑制的圖形特征非競爭性抑制的雙倒數(shù)圖形特征⑴非競爭性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類似；⑵底物和抑制劑分別獨立地與酶的不同部位相結(jié)合；⑶抑制劑對酶與底物的結(jié)合無影響，故提高底物濃度，不能消除抑制作用。⑷動力學(xué)參數(shù)：Km值不變，Vm值降低。非競爭性抑制的特點：2．反競爭性抑制（uncompetitiveinhibition)抑制劑不能與游離酶結(jié)合，但可與ES復(fù)合物結(jié)合并阻止產(chǎn)物生成，使酶的催化活性降低，稱酶的反競爭性抑制。反競爭反應(yīng)模式

=Vm[S]·Km

1+[I]Ki1+[I]Ki+[S]反競爭性抑制的速度方程反競爭性抑制的雙倒數(shù)方程反競爭性抑制的雙倒數(shù)圖形特征⑴反競爭性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類似；⑵抑制劑與底物可同時與酶的不同部位結(jié)合；⑶必須有底物存在，抑制劑才能對酶產(chǎn)生抑制作用；抑制程度隨底物濃度的增加而增加；⑷動力學(xué)參數(shù)：Km減小，Vm降低。反競爭性抑制的特點：競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制無抑制1/v1/[S]可逆抑制的動力學(xué)比較競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制結(jié)合部位活性中心活性中心以外活性中心以外增加底物濃度消除抑制不能消除抑制不能消除抑制Vmax不變降低降低Km增加不變降低第六節(jié)酶的活性調(diào)節(jié)一、變構(gòu)調(diào)節(jié)二、同工酶三、共價調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的各種生理活動均以一定的物質(zhì)代謝為基礎(chǔ)。為了適應(yīng)某種生理活動的變化，需要對一定的代謝活動進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過對酶的催化活性的調(diào)節(jié)，就可以達(dá)到調(diào)節(jié)代謝活動的目的?？梢酝ㄟ^改變其催化活性而使整個代謝反應(yīng)的速度或方向發(fā)生改變的酶就稱為限速酶(limitingvelocityenzyme)或關(guān)鍵酶(keyenzyme)。一、變構(gòu)調(diào)節(jié)（別構(gòu)調(diào)節(jié)）某些代謝物能與變構(gòu)酶分子上的變構(gòu)部位特異性結(jié)合，使酶的分子構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的催化活性以及代謝反應(yīng)的速度，這種調(diào)節(jié)作用就稱為變構(gòu)調(diào)節(jié)(allostericregulation)。酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)作用具有變構(gòu)調(diào)節(jié)作用的酶就稱為變構(gòu)酶(allostericenzyme)。凡能使酶分子變構(gòu)并使酶的催化活性發(fā)生改變的代謝物就稱為變構(gòu)劑(allostericeffector)。S型曲線：正協(xié)同效應(yīng)v[S]50米氏方程雙曲線變構(gòu)酶S型曲線變構(gòu)酶的特點1、一般由兩個或以上的亞基組成（寡聚酶），除有活性部位外，還有與調(diào)節(jié)物結(jié)合的調(diào)節(jié)部位（變構(gòu)部位）。2、具有變構(gòu)效應(yīng)：當(dāng)?shù)孜锘蛐?yīng)物和酶分子上的相應(yīng)部位結(jié)合后，會引起E分子構(gòu)象的改變，從而影響E的催化活性。3、不符合米氏曲線，多數(shù)為S型。4、變構(gòu)酶分子中一個活性部位能影響同一分子的另一個活性部位。變構(gòu)酶的解聚與聚合C——催化亞基R——調(diào)節(jié)亞基變構(gòu)酶活性調(diào)節(jié)的機(jī)理齊變模型亞基1亞基2SSSSTTRTRRRRSS序變模型天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ATCase）胞苷三磷酸（CTP）結(jié)構(gòu)：12個亞基，6個催化亞基（C），6個調(diào)節(jié)亞基（R）激活劑：ATP抑制劑：CTP（反應(yīng)途徑的終產(chǎn)物）氨甲酰磷酸+天冬氨酸↓（ATCase）氨甲酰天冬氨酸↓↓CTP結(jié)合于調(diào)節(jié)亞基，導(dǎo)致催化亞基構(gòu)象發(fā)生變化，酶活性降低，直至CTP濃度恢復(fù)ATCaseATP（正效應(yīng)劑）CTP（負(fù)效應(yīng)劑）低催化活性構(gòu)象T(tense)-態(tài)CCCCCC

RRRRRRCCCCCC高催化活性構(gòu)象R(relax)-態(tài)RRRRRRRMW3100006個340006個17000一、變構(gòu)酶天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶變構(gòu)酶的S形曲線v米氏酶變構(gòu)激活[S]變構(gòu)抑制變構(gòu)激活變構(gòu)酶非調(diào)節(jié)酶動力學(xué)特點：不符合米氏方程，v-[S]曲線為S形二、同工酶的調(diào)節(jié)催化同一反應(yīng)，但組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)有所不同的一組酶?；蚰艽呋嗤瘜W(xué)反應(yīng)的數(shù)種不同分子形式的E，稱為同工酶(isoenzyme)。同工酶在體內(nèi)的生理意義主要在于適應(yīng)不同組織或不同細(xì)胞器在代謝上的不同需要。LDH亞基分為M型和H型，4個亞基組成M型（肌型）——含堿性氨基酸H型（心型）——含酸性氨基酸LDH的5種四聚體：例：乳酸脫氫酶

由兩個基因（H、M）指導(dǎo)合成，則有H、M兩種亞基，他們之間相互組合，就會出現(xiàn)五種同工酶。HMLDH1

(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5

(M4)不同組織中LDH同工酶的電泳圖譜LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌腎肝骨骼肌血清-+原點心、肝病變時引起的血清LDH同工酶的變化規(guī)律：

心臟疾病初期

LDH1和LDH2上升，LDH1增高更早。

急性肝炎

LDH5明顯上升，隨病情好轉(zhuǎn)而恢復(fù)正常。

同工酶產(chǎn)生的機(jī)制不同的基因一組同工酶1.單體酶2.寡聚酶不同的基因一組同工酶（二）同工酶在代謝調(diào)控中的作用天冬氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸半醛高絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸賴氨酸AK1AK2AK3

幾種同工酶的存在，可能是機(jī)體對環(huán)境變化或代謝變化的另一種調(diào)節(jié)方式，當(dāng)一種同工酶受到抑制或破壞時，其他同工酶仍然起作用，從而保證代謝的正常進(jìn)行。(三)研究同工酶的意義1.同工酶可以作為遺傳標(biāo)志，進(jìn)行遺傳分析、雜種優(yōu)勢的篩選、抗逆指標(biāo)篩選心、肝病變時引起的血清LDH同工酶的變化規(guī)律：心臟疾病

H4上升;急性肝炎

M4明顯上升，隨病情好轉(zhuǎn)而恢復(fù)正常。2.同工酶譜的改變有助于對疾病的診斷3.研究代謝規(guī)律、個體發(fā)育三、共價修飾調(diào)節(jié)：酶蛋白分子中的某些基團(tuán)可以在其他酶的催化下發(fā)生共價修飾，從而導(dǎo)致酶活性的改變，稱為共價修飾調(diào)節(jié)。共價修飾調(diào)節(jié)也是體內(nèi)快速調(diào)節(jié)代謝活動的一種重要的方式。最常見的共價修飾方式有：磷酸化-脫磷酸化，-SH--S-S-，乙?；?