α-半乳糖苷酶檢測(cè)方法

a-半乳糖苷酶酶活力的測(cè)定方法1?a-半乳糖苷酶酶活力單位定義在pH5.5并37°C條件下，每分鐘內(nèi)底物降解釋放l“mol對(duì)硝基酚所需要的酶量為一個(gè)酶活單位U。2?測(cè)定原理a-半乳糖苷酶能將對(duì)硝基酚-a-D-吡喃半乳糖降解成對(duì)硝基酚。通過(guò)400nm比色測(cè)定釋放的對(duì)硝基酚的量，可以計(jì)算反應(yīng)液中a-半乳糖苷酶的活力。3?試劑與溶液除特殊說(shuō)明外，所用的試劑均為分析純，水均符合GB/T6682中規(guī)定的三級(jí)水。0.05mol/L醋酸鈉緩沖液：A液：稱取無(wú)水醋酸鈉4.2g定容至lOOOmL；B液：冰醋酸3.0mL定容至1000mL。用B液調(diào)節(jié)A液至pH5.5。0.2mol/L碳酸鈉溶液：準(zhǔn)確稱取21.198g無(wú)水碳酸鈉，定容至1000mL。對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)溶:(10mmol/L)稱取0.1391g對(duì)硝基苯酚，精確到0.001g,用碳酸鈉溶液定容至100mL,低溫保存。依次移取對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、7mL、9mL,用碳酸鈉溶液定容至100mL,配成濃度為0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L、0.9mmol/L的對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。10mmol/L對(duì)硝基酚-a-D-吡喃半乳糖溶液：稱取3.031g對(duì)硝基酚-a-D-吡喃半乳糖，用醋酸鈉緩沖液定容至1000mL，置棕色試劑瓶于4C以下保存。4?儀器與設(shè)備4.1實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī)或碾體。4.2分樣篩：孔徑為0.25mm(60目)。4.3分析天平：感量為O.OOlg。pH計(jì)：精確至0.01。磁力攪拌器：附加熱功能。電磁震蕩器4.7燒結(jié)玻璃過(guò)濾器：孔徑為0.45Amo4.8離心機(jī)：2000g以上。4.9恒溫水浴鍋：溫度控制范圍在30-60之間，精度為0.1°C。4.l0WhatmanNo.l濾紙。4.11分光光度計(jì)：能檢測(cè)350-800nm的吸光度范圍。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制吸取1mL對(duì)對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(3.3)于試管中，加入1mL醋酸鈉緩沖液(3.1)；對(duì)照的空白試管中加入2mL醋酸鈉緩沖液(3.1)；在所有的試管中加入8mL碳酸鈉溶液(3.2)，振蕩，在400nm處測(cè)定吸光度OD值。以對(duì)硝基酚濃度為Y軸、吸光度OD值為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試樣溶液的制備固體試樣應(yīng)粉碎或充分碾碎，然后過(guò)60目篩(孔徑為0.25mm)。稱取固體樣品1g左右，用80mL醋酸鈉緩沖液(3.1)浸泡，磁力攪拌30分鐘，用醋酸鈉緩沖液(3.1)定容至100mL，用WhatmanNo.1濾紙過(guò)濾。液體試樣可以直接用醋酸鈉緩沖液(3.1)進(jìn)行稀釋和定容。當(dāng)酶液的酶活在20U/mL以內(nèi)，測(cè)試結(jié)果較準(zhǔn)確。測(cè)定步驟將上速稀釋酶液(6)和底物對(duì)硝基酚-a-D-吡喃半乳糖溶液(3.4)于37C下振蕩10分鐘預(yù)熱。然后再吸取各溶液0.1mL，充分混合，于37C恒溫振蕩10分鐘，加入0.8mL碳酸鈉溶液(3.2)，振蕩混勻，終止酶反應(yīng)，以蒸餾水調(diào)零，在400nm處測(cè)定吸光度OD值。酶液空白用經(jīng)過(guò)預(yù)熱的酶液各0.1mL，然后加入0.8mL碳酸鈉溶液(3.2),振蕩混勻，再各加入0.1mL預(yù)熱的底物對(duì)硝基酚-a-D-吡喃半乳糖溶液(3.4)于37C振蕩10分鐘，在400nm處測(cè)定吸光度OD值。8.試樣酶活力的計(jì)算([Ax-Ao]*K+Co)*DfX=Ax——樣品酶液的吸光度OD值；Ao——對(duì)應(yīng)酶液的空白吸光度OD值；K——對(duì)硝基酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；Co——對(duì)硝基酚的標(biāo)準(zhǔn)曲的截距；Df——稀釋倍數(shù)；M——稱取酶制劑的質(zhì)量g;T 反應(yīng)時(shí)間min;X---試樣a-半乳糖苷酶的活力U/g；9.重復(fù)性同一樣品兩個(gè)平行測(cè)定值的相對(duì)誤差不超過(guò)8.0%，二者的平均值為最終的酶活力測(cè)定值（保留三位有效數(shù)字）。甘露聚糖酶活力的測(cè)定方法1.甘露聚糖酶活力單位定義在37°C、pH值為5.5的條件下，每分鐘從濃度為3mg/mL的甘露聚糖溶液中降解釋放lymol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位U。測(cè)定原理甘露聚糖酶能將甘露聚糖降解成寡糖和單糖。具有還原性末端的寡糖和有還原基團(tuán)的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)。反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應(yīng)液中的甘露聚糖酶的活力成正比。因此，通過(guò)分光比色測(cè)定反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度，可以計(jì)算反應(yīng)液中甘露聚糖酶的活力。試劑與溶液除特殊說(shuō)明外，所用的試劑均為分析純，水均符合GB/T6682中規(guī)定的三級(jí)水。甘露糖溶液，c(C6H12O6)為10.0mg/mL：稱取無(wú)水D-甘露糖l.OOOg，加水溶解，定容至100mL。乙酸溶液，c(CH￡OOH)為O.lmol/L：吸取冰乙酸0.60mL。加水溶解，定容至100mL。乙酸鈉溶液，c(CHfOONa)為0.1mol/L：稱取三水乙酸鈉1.36g。加水溶解，定容至100mL。3.4氫氧化鈉溶液，c(NaOH)為200g/L：稱取氫氧化鈉20.0g。加水溶解，定容至100mL。乙酸一乙酸鈉緩沖溶液，c(CH3COOH--CH3COONa)為0.1mol/L,pH值為5.5：稱取三水乙酸鈉23.14g,加入冰乙酸1.70mL。再加水溶解，定容至2000mL。測(cè)定溶液的pH值。如果pH值偏離5.5，再用乙酸溶液(3.2)或乙酸鈉溶液(3.3)調(diào)節(jié)至5.5。甘露聚糖溶液，0.6%(w/v)稱取甘露聚糖(SigmaG0753)0.60g，加入80mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(3.5)。磁力攪拌同時(shí)緩慢加熱至甘露聚糖完全溶解(注：在攪拌加熱的過(guò)程中可以補(bǔ)加適量的緩沖溶液，但是溶液的總體積不能超過(guò)100mL)。然后停止加熱，繼續(xù)攪拌30min，用乙酸乙酸鈉緩沖溶液(3.5)定容至100mL。甘露聚糖溶液能立即使用，使用前適當(dāng)搖勻O4C避光保存，有效期為3天。3.7DNS試劑稱取3,5-二硝基水楊酸3.15g（化學(xué)純），加水500mL，攪拌5s,水浴至45°C。然后逐步加入100mL氫氧化鈉溶液（3.4），同時(shí)不斷攪拌，直到溶液澄清透明（注意：在加入氫氧化鈉過(guò)程中，溶液溫度最好不要超過(guò)48C。）再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0g、苯酚2.50g和無(wú)水亞硫酸鈉2.50g。繼續(xù)45C水浴加熱，同時(shí)補(bǔ)加水300mL，不斷攪拌，直到加入的物質(zhì)完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1000mL。用燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾。取濾液，儲(chǔ)存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7天后可以使用，有效期為6個(gè)月。儀器與設(shè)備實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī)或碾體。分樣篩：孔徑為0.25mm（60目）。4.3分析天平：感量為O.OOlg。4.4pH計(jì)：精確至0.01。磁力攪拌器：附加熱功能。電磁震蕩器4.7燒結(jié)玻璃過(guò)濾器：孔徑為0.45Amo4.8離心機(jī)：2000g以上。4.9恒溫水浴鍋：溫度控制范圍在30-60C之間。精度為0.1Co4.10秒表：每小時(shí)誤差不超過(guò)5s。4.11分光光度計(jì)：能檢測(cè)350-800nm的吸光度范圍。4.12移液器：精度為1L標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制吸取緩沖液（3.5）4.0mL，加入DNS試劑（3.7）5.0mL，沸水浴加熱5min。用自來(lái)水冷卻至室溫，用水定容至25.0mL，制成標(biāo)準(zhǔn)空白樣。分別吸取甘露糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00mL，分別用緩沖液（3.5）定容至100mL，配制成濃度為0.10-0.70mg/mLD-甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取上述濃度系列的甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.00mL（做兩個(gè)平行），分別加入到刻度試

管中，再分別加入2mL緩沖液（3.5）和5mLDNS試劑（3.7）。電磁震蕩3s,沸水浴加熱5min。然后用自來(lái)水冷卻至室溫，再用水定容至25mL。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣對(duì)照調(diào)零，在540nm處測(cè)定吸光度OD值。以甘露糖濃度為Y軸、吸光度OD值為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試樣溶液的制備固體試樣應(yīng)粉碎或充分碾碎，然后過(guò)60目篩（孔徑為0.25mm）。稱取試樣兩份，精確至O.OOlg。加入50mL乙酸一乙酸鈉緩沖溶液（3.5））磁力攪拌30min,再用緩沖液（3.5）定容至100mL,在4°C條件下避光保存24h。搖勻，取出30-50mL,2000g離心3min。吸取5.00mL上清夜，再用緩沖液（3.5）做二次稀釋（稀釋后的待測(cè)酶液中甘露聚糖酶的活力最好能控制在0.04-0.08U/mL之間）。液體試樣可以直接用乙酸一乙酸鈉緩沖溶液（3.5）進(jìn)行稀釋和定容（稀釋后酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.04-0.08U/mL之間）。如果稀釋后酶液的pH值偏離5.5，需要用乙酸溶液（3.2）或乙酸鈉溶液（3.3）調(diào)節(jié)至5.5，然后再用緩沖溶液（3.5）做適當(dāng)定容。測(cè)定步驟吸取lO.OmL甘露聚糖溶液（3.6）,37C平衡lOmin。吸取10.0mL經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的酶液，37C平衡10min。吸取2.0mL經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的酶液（已經(jīng)過(guò)37C平衡），加入到刻度試管中，再加入5mLDNS試劑（3.7）,震蕩5s。然后加入2.0mL甘露聚糖溶液（3.6），37C保溫30min，沸水浴加熱7min，用自來(lái)水冷卻至室溫，加水定容至25mL，震蕩3s。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為空白對(duì)照，在540nm處測(cè)定吸光度AB。B吸取2.0mL經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的酶液（已經(jīng)過(guò)37C平衡），加入到刻度試管中，再加入2.0mL甘露聚糖溶液（3.6）（已經(jīng)過(guò)37C平衡），震蕩5s，37C精確保溫30min。加入5mLDNS試劑（3.7）,震蕩3s，以終止酶解反應(yīng)。沸水浴加熱7min,用自來(lái)水冷卻至室溫，加水定容至25mL，震蕩3s。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為空白對(duì)照，在540nm處測(cè)定吸光度Ae。E8試樣酶活力的計(jì)算XD=(AeXD=(Ae-AB)xK+Co〕EB OMxWxtxlOOO式（1）中：XD---試樣稀釋液的甘露聚糖酶活力，U/mL；AE---酶反應(yīng)液的吸光度；EAB---酶空白樣的吸光度；K---標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；CO---標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；M---甘露糖的分子量（180.2）；W--樣品