自制cpc納米復合材料生物相容性的初步評價

自制cpc納米復合材料生物相容性的初步評價

傷口、腫瘤和感染引起的大面積骨缺損是骨科和口腔面部臨床感染的難題。CPC(CalciumPhosphateCement,CPC)具有良好的生物相容性、可降解性及骨傳導性能,并集成型、臨床應用于一身,可根據(jù)缺損部位在室溫或近似體溫狀態(tài)下任意塑形固化,操作簡便,克服了陶瓷燒結(jié)型HA材料成型困難、不易降解、成型溫度高等缺點。CPC可廣泛用于整形外科、牙科、骨移植、骨缺陷修復、細胞和活性因子載體,注射型CPC還可用于微創(chuàng)骨移植(Micro-invasivebonegrafting)。正是由于上述諸多優(yōu)點,CPC作為一種新型的骨組織修復和替代材料,受到了國內(nèi)外眾多學者的廣泛關(guān)注,然而其自身所存在的諸如抗水溶性(血溶性)差、固化速度慢、孔徑較小、降解速度緩慢、機械強度不足等缺點極大地限制了其在更廣泛領(lǐng)域的應用。本實驗按照國際標準化組織ISO10993醫(yī)療器械和生物材料生物學評價試驗指南標準,選擇溶血試驗和經(jīng)口途徑短期全身急性毒性試驗,在2009年9-12月期間,對自制CPC納米復合材料的生物相容性進行初步的評價。從而為其在臨床骨缺損修復領(lǐng)域中的應用提供實驗依據(jù)。1材料和方法1.1溶血試驗1.1.1考試前準備1超聲清洗、干燥將CPC納米復合材料制成直徑為5mm厚度為1mm的圓形試樣,用蒸餾水超聲清洗30min,用蒸餾水沖洗3遍,在37℃電熱恒溫箱內(nèi)干燥,包裝,環(huán)氧乙烷滅菌2h后備用。21新鮮抗凝人血制備取新鮮健康人靜脈血20mL,加入2%苯鉀酸1mL,貯存于4℃冰箱。3餾水中吸光度取新鮮抗凝血8mL稀釋于10mL的生理鹽水中。將0.2mL人血樣本加入10mL蒸餾水中,在分光光度計541.50nm波長下測量吸光度為1.237,在稀釋抗凝人血中加入5mL生理鹽水稀釋,重新在紫外分光光度計541.50nm波長下測量吸光度為0.886,符合吸光度應在0.8±0.3的標準要求范圍內(nèi)。將制備好的稀釋抗凝人血貯存于4℃冰箱。42準備機器和試劑2%苯鉀酸抗凝劑,紫外分光光度計TV1901(北京普析通用儀器有限責任公司)。1.1.2材料浸提液用量測定將已準備好的試驗材料浸泡10mL生理鹽水試管中;陽性對照:10mL蒸餾水的試管;陰性對照:10mL生理鹽水的試管。試驗組和陰性、陽性對照組均需重復3只試管,另設(shè)材料浸提液底色組1支試管。將10支試管放在37℃恒溫水浴箱中30min后(除底色組外),每支試管中加0.2mL稀釋人血,緩慢混合,在37℃恒溫水浴箱中維持60min。所有試管3000r·min-1離心5min,分別吸取各試管上清液,用分光光度計在波長為540nm下測吸光度,記錄結(jié)果,每組3支試管的均值為該組的吸光度值。溶血程度按下面公式計算:溶血率=[(試驗材料與陰性對照之間吸光度差)/(陽性對照與陰性對照之間吸光度差)]×100%。1.1.3急性溶血反應各組吸光度實測值和試驗材料溶血程度見表1。判定標準:溶血程度<5%時不會發(fā)生溶血。材料浸提液組和生理鹽水組試管中紅細胞沉聚于底部,上層液體變成清亮淺黃色,蒸餾水組呈紅色混濁。本實驗結(jié)果提示,CPC復合材料的溶血率為0.1%,小于5%,體外實驗不引起明顯溶血反應,可認為自制CPC納米復合材料不會引起急性溶血。符合國家標準,可以滿足醫(yī)用生物材料的應用要求。1.2短期全身毒性試驗1.2.1考試前準備12準備材料天平:分度值為0.01g;灌胃針頭,2mL注射器。2材料的浸提將CPC納米復合材料試樣依據(jù)GB16886.11標準,按表面積/浸提介質(zhì)為3cm2/mL的比例,將材料置于盛有生理鹽水的紺渦中,37℃恒溫水浴箱浸提72h。對照組采用同等體積生理鹽水,相同條件下浸提。浸提完畢,震蕩紺渦,將浸提液倒入燒杯,115℃高壓滅菌30min。3體質(zhì)量ld5020只SD大鼠(華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供,日齡56d),雌雄各半。體質(zhì)量230～400g。分為實驗組和對照組,每組10只,雌雄各半。飼養(yǎng)時,每個籠中放同性別、服用同一材料的大鼠5只,并標記大鼠。1.2.2浸提液的制備用連有灌胃針頭的注射器給服材料浸提液。給服材料前禁食4～8h,禁食期間不禁水。給服材料浸提液劑量為每天5mL·kg-1體質(zhì)量,對照組給服同體積的浸提介質(zhì)。連續(xù)給服7d,然后觀察1周。1.2.3每只動物體質(zhì)量增長曲線每天觀察動物臨床毒性體征。每天稱重并記錄各動物體質(zhì)量及每組動物食物消耗量。①計算每周每組動物食物利用率,即每吃100g食物所增長的體質(zhì)量克數(shù)。②計算每只動物體質(zhì)量相對增長率,即體質(zhì)量增長數(shù)與原始體質(zhì)量數(shù)的百分比,并將試驗組與對照組每周體質(zhì)量相對增長率做統(tǒng)計處理。病理解剖宏觀觀察動物的重要臟器,觀察有無充血、出血、水腫或其他變化。如有異常,應進行常規(guī)組織病理切片觀察。并對結(jié)果評價。2大鼠體質(zhì)量及重要臟器健康按照YY/T0244標準的評價要求對試驗結(jié)果進行評價,實驗結(jié)果使用t檢驗和方差分析進行統(tǒng)計學分析。在14d觀察期內(nèi),實驗組和對照組大鼠活躍、反應敏捷、毛色光亮、進食正常。在給服材料期間,實驗組和對照組動物均出現(xiàn)給服后短時間的食欲低下,各組大鼠均未見出現(xiàn)運動機能減退、呼吸困難、腹瀉及其他毒性癥狀,無動物死亡現(xiàn)象。第1周對照組體質(zhì)量相對增長率平均值為2%,實驗組體質(zhì)量相對增長率平均值為2.1%。第2周對照組體質(zhì)量相對增長率平均值為2.4%,試驗組體質(zhì)量相對增長率平均值為3.7%。第1周對照組食物利用率為5.4%,實驗組食物利用率為4.7%。第2周對照組食物利用率為4.7%,實驗組食物利用率為7.3%。各組大鼠每周食物利用率及體質(zhì)量相對增長率見表2。統(tǒng)計分析表明體質(zhì)量增長各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表3,14d后處死動物,肉眼觀察動物心、肺、消化道、肝、脾、胰、腎、腎上腺、生殖腺等重要臟器均未出現(xiàn)異常變化。病理組織切片(封三圖1)檢查未見實驗及對照組動物心、肺、消化道、肝、脾、胰、腎、腎上腺、生殖腺等重要臟器出現(xiàn)充血、出血、水腫或其他病理學變化。根據(jù)毒性評定標準判定,自制CPC納米復合材料對機體無毒性。3實驗結(jié)果及分析由于生物材料要用于人體,有的甚至終生存留體內(nèi)。因此,任何新材料在應用于臨床之前,首先必須按照醫(yī)療器械生物學評價GB/T16886序列標準和要求進行嚴格的生物安全性評價,除需符合要求的機械及理化性能外,還要有各種安全性和有效性數(shù)據(jù)資料。生物醫(yī)用材料的相容性主要分為兩類,一類是血液相容性,即與血液的相互作用;另一類是組織相容性,即與周圍組織之間的相互作用。本實驗以九江學院江西省系統(tǒng)生物學臨床應用重點實驗室制備的CPC納米復合材料為研究對象,參照GB/T16886標準規(guī)定的原則和實驗方法,選擇溶血試驗、經(jīng)口途徑短期全身急性毒性試驗對自制CPC納米復合材料進行生物相容性和安全性評價,為該材料下一步臨床應用的安全性提供有價值的理論依據(jù)。溶血試驗是一項有意義的急性毒性篩選實驗,主要是針對與血液接觸材料的血液相溶性評價項目,其目的是檢測試驗材料對血液紅細胞的溶血作用,該試驗應用比較普遍,能夠敏感地反映材料對紅細胞膜的影響。自制CPC納米復合材料主要用于骨組織,在應用過程中會與血液接觸。根據(jù)中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標準,長期與血液直接或間接接觸的種植生物材料必須對其血液相容性進行評價。溶血的原因包括材料表面機械損傷和材料可溶性殘余分子化學作用兩方面后一種原因中,材料殘余單體及低分子物質(zhì)能使紅細胞膜的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的量和質(zhì)發(fā)生異常,導致紅細胞的完整性遭到破壞而發(fā)生溶血。因此本實驗選擇了該項評價試驗,通過用紫外分光光度計測量材料與血細胞在體外接觸過程中所致紅細胞溶解游離血紅蛋白的吸光度值,計算其溶血程度,得到其溶血率為0.1%,遠遠小于標準規(guī)定的5%,結(jié)果說明自制CPC納米復合材料不會引起溶血反應,血液相容性良好,符合醫(yī)用材料的溶血試驗要求。短期全身毒性試驗是評價材料在短期內(nèi)經(jīng)口服用后對生物體的毒性作用。YY標準中所采用的是經(jīng)口途徑的方法,將材料的浸提液灌注入動物胃內(nèi),經(jīng)過14d材料浸提液與動物的相互作用,通過觀察動物對其反應以及體質(zhì)量的變化從而判斷材料是否有全身毒性,本實驗采用胃內(nèi)直接灌注給藥,保證了給藥劑量,可準確的評價材料的毒性。實驗過程中,試驗組和對照組大鼠活躍、反應敏捷、毛色光亮、進食正常、體重增加。在給服材料期間,試驗組和對照組動物均出現(xiàn)給服后短時間的食欲低下,給服兩小時后食欲恢復正常。各組大鼠均未出現(xiàn)運動機能減退、呼吸困難、腹瀉及其他毒性癥狀,無動物死亡現(xiàn)象。14d后處死動物,肉眼觀察動物心、肺、消化道、肝、脾、胰、腎、腎上腺、生殖腺等重要臟器,