第20章 高效液相色譜

第20章高效液相色譜法本章學(xué)習(xí)要點高效液相色譜法的特點高效液相色譜儀基本構(gòu)造液相色譜固定相及分離原理液相色譜流動相的選擇作業(yè)：20-1;20-2;20-4;20-7;20-10第20章高效液相色譜法20-1概述20-2高效液相色譜儀20-4液固色譜20-5化學(xué)鍵合相色譜20-6離子交換色譜與離子色譜20-7離子對色譜20-8尺寸排阻色譜20-9超臨界流體色譜簡介*20-1概述一、高效液相色譜的特點二、高效液相色譜的分類一、高效液相色譜的特點(1)高效液相色譜與氣相色譜的比較分析對象流動相色譜柱溫度分析對象氣相色譜：氣體和沸點較低的化合物，

占有機物總數(shù)20%高效液相色譜：高沸點、熱穩(wěn)定性差、分子量大的物質(zhì)，

占有機物總數(shù)80%流動相氣相色譜流動相：對組分沒有親和力的惰性氣體，對分離選擇性幾乎無影響高效液相色譜流動相：可選用不同極性的液體選擇余地大對分離影響大（與組分或固定相均作用）色譜柱溫氣相色譜柱溫：一般較高高效液相色譜柱溫：通常為室溫一、高效液相色譜的特點(2)高壓：150-350105Pa高速：一般<1h,<1min.高效：柱效高高靈敏度：10-9g(紫外檢測器）

10-12g（熒光檢測器）WatersUPLC–超高效液相色譜高靈敏度高分辨率高速度壓力高達15,000psi填料顆粒度1.7μm……超高效液相色譜遵循范德米特方程小顆粒度填料提高分離度

3D圖譜比較HPLCUPLCRatUrine一、高效液相色譜的特點(3)方法的局限性成本高、環(huán)境污染、梯度洗脫操作復(fù)雜。缺少靈敏度高的通用型檢測器復(fù)雜樣品分離，缺少總理論塔板數(shù)達數(shù)十萬的色譜柱。受壓易分解或變性的生物樣品局限1成本高、環(huán)境污染、梯度洗脫操作復(fù)雜。Solution:微型化（毛細管色譜柱）、水為流動相等Nanoborecolumn(0.025mmi.d.0.1mm)ChipcolumncoupledtoMS

ZORBAX300SBC185μmparticlesH.-F.Yinetal.,presentedatthe18thInternationalSymposiumonMicroscaleSeparationsandAnalysis,HPCE,SanDiego,January2003.Separationofpeptidesonchipcolumn局限2缺少靈敏度高的通用型檢測器Solution:蒸發(fā)光散射檢測器

Corona電霧式檢測器（ChargedAerosolDetector，CAD）局限3復(fù)雜樣品分離，缺少總理論塔板數(shù)達數(shù)十萬的色譜柱。Solution:UPLC(UHPLC)Thesamplewasrunusingconstant-flowpumpsat52000psiona38cmlongcapillarypackedwith1.0μmC18particles.二、高效液相色譜的分類按分離原理分類：分配色譜吸附色譜離子交換色譜尺寸排阻色譜疏水作用色譜二、高效液相色譜的分類按分離規(guī)模分類：制備色譜柱內(nèi)徑>10mm半制備色譜柱內(nèi)徑>5-10mm分析型色譜柱內(nèi)徑<5mm21-2高效液相色譜儀高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)高效液相色譜儀的主要部件20-2高效液相色譜儀一、高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)二、高效液相色譜儀的主要部件高壓輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)附屬系統(tǒng)(一）高壓輸液系統(tǒng)儲液罐高壓輸液泵過濾器壓力脈動阻尼器1.儲液罐必須有足夠的容積與溶劑不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)便于對溶劑進行脫氣不銹鋼、玻璃、氟材料容積：500-2000cm3溶劑的過濾與脫氣過濾：除去溶劑中的固體微粒脫氣：除去溶劑中溶解的氣體過濾過濾脫氣加熱法抽真空吹氦氣超聲波在線脫氣超聲波清洗器2.高壓輸液泵對泵性能的要求輸出壓力高150-300kg/cm2500kg/cm2流量范圍廣0.1--10cm3/min

可調(diào)流量穩(wěn)定無脈動，流量精度0.5%左右耐腐蝕適用于各種有機溶劑、水、緩沖溶液往復(fù)泵單泵與雙泵脈動阻尼器過濾器燒結(jié)不銹鋼材料制成孔徑：2-10m（二）進樣系統(tǒng)取樣和進樣功能手動和自動要求：密封性好死體積小重復(fù)性好進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力和流量波動小進樣1進樣2進樣3自動進樣器(三)分離系統(tǒng)色譜柱柱箱*色譜柱柱材料：不銹鋼柱長度：5-30cm柱內(nèi)徑：2-5mm填料：3-10m填充：勻漿法高效液相色譜柱高效液相色譜柱勻漿法裝柱示意圖勻漿法裝柱示意圖高效液相色譜填料填料熱力學(xué)特性影響色譜柱的選擇性填料的動力學(xué)性質(zhì)或結(jié)構(gòu)特點影響色譜柱的效率顆粒的大小、形狀、均勻性、比表面積孔徑、孔體積等。高效液相色譜填料（物理形態(tài)）全多孔型（porousparticle)球形不規(guī)則形無孔小粒徑型(non-poroussmallparticle)表面多孔型(porouslayerbeads)貫流型粒子(flow-throughparticle)貫穿孔(throughpores,600-800nm)擴散孔(diffusepores,50-150nm)連續(xù)床(整體柱）(monolithicstationaryphase)全多孔型（porousparticle)孔的類型微孔孔徑<2nm中孔孔徑<50nm,>2nm大孔孔徑>50nm使用中孔和大孔填料微孔易造成色譜峰拖尾表面多孔型(porouslayerbeads)貫流型粒子(flow-throughparticle)頤和園整體柱材料

高效液相色譜填料的基質(zhì)無機基質(zhì)材料硅膠(silica)、氧化鋁、氧化鋯、氧化鈦、羥基磷灰石、多孔玻璃、多孔石墨碳等有機基質(zhì)材料：天然多糖凝膠（如葡聚糖系、瓊脂糖系等）高聚物樹脂（如交聯(lián)苯乙烯樹脂、交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯類樹脂等）色譜用硅膠基質(zhì)材料硅膠的表面硅膠的化學(xué)穩(wěn)定性硅膠的物理性質(zhì)多孔硅膠的制備多孔硅膠的表面改性（1）硅膠的表面暴露于表面的Si-O-Si（疏水）硅羥基Si-OH吸附水硅膠表面的硅羥基硅羥基濃度：8.0±0.1

mol/m2吸附水(2)硅膠的化學(xué)穩(wěn)定性一般可以耐受酸性介質(zhì)的侵蝕在純水中的平衡溶解度100mg/LpH>9時溶解度顯著增加溶解度與粒徑有關(guān)（3）硅膠的物理性質(zhì)顆粒的形狀與大小孔徑大小及其分布微孔<2nm;中孔(2-50nm);大孔>50nm比孔容(mL/g)比表面積機械強度(4)多孔硅膠的制備兩相法噴霧干燥法堆積硅珠法生物微囊法改進兩相法制得硅膠武漢大學(xué)國外知名品牌大孔球形硅膠（5）多孔硅膠的表面改性與修飾表面化學(xué)修飾整體改性聚合物包覆法表面化學(xué)修飾硅烷化試劑與硅羥基反應(yīng)硅烷化試劑氯硅烷烷氧基硅烷(四）檢測系統(tǒng)---檢測器理想檢測器應(yīng)具有的特點：靈敏度高對所有的樣品都有響應(yīng)對溫度和流速波動不敏感死體積小對樣品無破壞性對溶劑無響應(yīng)，能用于梯度洗脫線性范圍寬重現(xiàn)性好、響應(yīng)時間快能給出定性信息溶質(zhì)性質(zhì)檢測器：對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等總體檢測器：對試樣和流動相總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)示差折光檢測器、電導(dǎo)檢測器等檢測器的分類幾種常用檢測器簡介紫外光度檢測器(ultravioletphotometricdetector)光電二極管陣列檢測器(photo-diodearraydetector)熒光檢測器(fluorescencedetector)示差折光檢測器(differentialrefractiveindexdetector)蒸發(fā)光散射檢測器（evaporativelightscatteringdetector)電導(dǎo)檢測器(electricalconductivitydetector)(1)紫外光度檢測器應(yīng)用最廣泛的一種高效液相色譜檢測器約80%的樣品固定波長可變波長紫外光度檢測器光路圖紫外光度檢測器光路圖(2)光電二極管陣列檢測器三維色譜-光譜圖光電二極管陣列檢測器的主要特點可獲得三維色譜-光譜圖的檢測器三維色譜-光譜圖：時間-波長-吸收值波長范圍：190-950nm可同時獲得不同波長條件下的色譜圖可利用色譜保留值及光譜特征吸收曲線定性可判別色譜峰的純度及分離狀態(tài)(3)熒光檢測器利用某些試樣具有熒光特性建立的檢測方法高靈敏度和高選擇性（檢出限10-12-10-13g/cm3)稠環(huán)芳烴、甾族化合物、酶、氨基酸、維生素、色素、蛋白質(zhì)等熒光物質(zhì)。熒光檢測器光路圖(4)示差折光檢測器連續(xù)測定流出液折光指數(shù)的變化通用型檢測器，但靈敏度較低（10-7g/cm3)反射式示差折光檢測器偏轉(zhuǎn)式示差折光檢測器干涉式示差折光檢測器偏轉(zhuǎn)式示差折光檢測器光路圖示差折光檢測器使用要點流動相組成要恒定（變化值<10-6）溫度恒定（樣品池與參比池的溫差±10-4C)壓力恒定（檢測池不耐壓）流速穩(wěn)定（流量波動<5%）不可用于梯度洗脫（5）蒸發(fā)光散射檢測器通用型檢測器不需要衍生便可檢測任何不帶發(fā)色基團的化合物比示差折光檢測器更佳的靈敏度及穩(wěn)定性對溫度變化不敏感可用于梯度洗脫響應(yīng)值與樣品質(zhì)量有關(guān)，對所有樣品的檢測給出近乎一樣的響應(yīng)因子測定物質(zhì)的純度和定量測定未知物蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)蒸發(fā)光散射檢測器工作原理ELSD和RI的基線穩(wěn)定性及靈敏度比較應(yīng)用例1應(yīng)用例2應(yīng)用例3電霧式檢測器ChargedAerosolDetector，CAD(6)電導(dǎo)檢測器基于物質(zhì)在某些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生電導(dǎo)變化進行測定的檢測器主要應(yīng)用于離子色譜受溫度影響較大電導(dǎo)檢測器結(jié)構(gòu)示意圖(7)聯(lián)用技術(shù)HPLC-MSHPLC-NMRHPLC-FTIRUPLC-SQDHTCUltraAgilent6210LC-TOFMSLC-MSQuatroPremier(Q-Q-Q)QTofPremier

Q-Trap(Q-Q-LT)LC-MS(多級質(zhì)譜串聯(lián))APCIAPPIapplication(8)梯度淋洗裝置低壓梯度高壓梯度高效液相色譜的主要類型液固色譜化學(xué)鍵合相色譜離子交換色譜與離子色譜離子對色譜尺寸排阻色譜親和色譜20-4液固色譜（吸附色譜）固定相保留機理流動相及其選擇應(yīng)用例一、固定相液固色譜的固定相-固體吸附劑常用：硅膠和氧化鋁其它：氧化鋯、氧化鈦、氧化鎂、分子篩、聚酰胺、活性炭等等硅膠是最重要的液固色譜的固定相硅膠的表面結(jié)構(gòu)與性質(zhì)二、保留機理液-固色譜采用極性固體吸附劑如硅膠等作為固定相。根據(jù)流動相的極性不同，在固體吸附劑表面形成單分子或雙分子層溶劑分子吸附層。當(dāng)樣品分子進入色譜體系，溶質(zhì)保留和分離選擇性決定于：溶質(zhì)分子和溶劑分子與吸附劑表面活性點的競爭。流動相對樣品的溶解能力。溶質(zhì)分子的各種官能團與吸附劑表面活性點的分子間相互作用。二、保留機理硅膠的吸附中心極性相互作用對試樣的保留順序選擇性硅膠的吸附中心硅膠的吸附中心硅羥基與樣品組分相互作用偶極-誘導(dǎo)偶極偶極-偶極氫鍵-絡(luò)合物（孤對電子、雙鍵）極性相互作用選擇性有利于異構(gòu)體的分離三、流動相及其選擇溶劑強度單一溶劑混合溶劑溶劑的選擇性流動相選擇規(guī)則溶劑強度Snyder提出的溶劑強度參數(shù)

0混合溶劑的強度溶劑的選擇性流動相的選擇規(guī)則“B濃度規(guī)則”(“B-concentrationrule”)薄層色譜B濃度規(guī)則弱強度溶劑A+強溶劑B=流動相改變強溶劑B濃度，優(yōu)化容量因子為提高選擇性，在等強度條件下，選擇其它具有不同選擇性的B溶劑，直到獲得最佳流動相組成。四、應(yīng)用例吸附色譜的優(yōu)勢：異構(gòu)體分離例1例2例320-5化學(xué)鍵合相色譜采用化學(xué)鍵合相作為固定相的液相色譜稱化學(xué)鍵合相色譜法特點：固定相穩(wěn)定性好適合于梯度洗脫應(yīng)用范圍廣化學(xué)鍵合相色譜鍵合固定相類型鍵合固定相的制備反相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法一、鍵合固定相類型鍵合固定相的基質(zhì)材料主要為硅膠（1）疏水基團

不同鏈長的烷烴（C8,C18）和苯基等（2）極性基團氨丙基、腈乙基、醇和醚等（3）其它基團

離子交換基、手性識別基、配基（如酶、抗原、激素等）二、鍵合固定相的制備（1）硅酸酯二、鍵合固定相的制備（2）Si-C和Si-N型二、鍵合固定相的制備（3）硅烷化三、反相鍵合相色譜法流動相極性大于固定相的色譜法固定相保留機理溶劑強度溶劑選擇性流動相及其選擇應(yīng)用例（1）固定相最常用的固定相：C18(ODS:chemicallybondedoctadecylsilane)C8和其它短鏈烷烴、苯基鍵合硅膠固定相ODS示意圖（2）保留機理疏溶劑作用理論試樣組分的流出順序組分流出順序為：疏水性小者先流出疏水性大者后流出（3）溶劑強度反相液相色譜最常用的溶劑：甲醇(methanol)、乙腈(acetonitril)、四氫呋喃(tetrahydrofuran)、水（緩沖溶液）用極性參數(shù)P表示極性大，強度弱；極性小，強度強（為什么？）Pmethanol5.1Pacetonitril5.8Ptetrahydrofuran4.0Pwater10.2混合溶劑的強度PAB=

APA+BPB（4）溶劑選擇性（5）流動相及其選擇反相液相色譜流動相的基本組成：水+有機改性劑（甲醇或乙腈或四氫呋喃）選擇：1.用水和甲醇（或乙腈）的混合溶劑為流動相，通過改變混合比優(yōu)化

k2.等強度更換有機改性劑，提高選擇性流動相選擇例（6）應(yīng)用例高爾夫球場殺蟲劑的分離梯度四、正相鍵合相液相色譜法流動相極性小于固定相極性的鍵合相液相色譜法固定相：含有極性基團的鍵合相，如-CN,-NH2,-OH流動相：流動相組成與液固色譜相同，但強度用極性參數(shù)

P應(yīng)用：分離異構(gòu)體、極性不同的化合物、不同類型的化合物非離子表面劑的分離20-6離子交換色譜與離子色譜以離子交換劑為固定相，借助于試樣中電離組分對固定在交換劑上的帶相反電荷的離解部位親合力，使其彼此分離。分離對象：離子或在溶液中可電離的物質(zhì)無機離子混合物有機物：氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等主要內(nèi)容離子交換原理固定相流動相應(yīng)用例離子排斥色譜離子色譜一、離子交換原理離子交換通式陽離子交換R-SO3-H++M+R-SO3-M++H+陰離子交換R-NR3+Cl-+X-R-NR3+X-+Cl-離子交換通式一般形式：R-A+BR-B+A平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）二、固定相離子交換劑基質(zhì)材料：合成樹脂（苯乙烯）、纖維素、硅膠帶電基團：陽離子交換劑、陰離子交換劑強陽離子交換劑SCX-SO3H弱陽離子交換劑WCX-CO2H強陰離子交換劑SAX-N+R3弱陰離子交換劑WAX-NH2常用的離子交換劑多孔型離子交換樹脂粒徑5-20m交換容量高柱效低薄膜型離子交換樹脂表面多孔型離子交換樹脂柱效高交換容量低離子交換鍵合固定相機械強度高柱效高理論交換容量：每克干樹脂所含離子交換基團的量三、流動相一定pH值和鹽濃度的緩沖溶液流動相強度和選擇性(k,)鹽濃度（離子強度）種類pH(1)流動相中鹽濃度的影響鹽濃度增加，降低試樣組分在固定相上的保留。(2)鹽種類的影響陰離子交換：洗脫強度：檸檬酸離子>SO42->C2O42->I->NO3->CrO42->Br->SCN->Cl->HCOO->CH3COO->OH->F-陽離子交換：洗脫強度：Ba2+>Pb2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>Co2+>Zn2+>Mg2+>Ag+>Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+

(3)pH的影響強離子交換劑：pH影響弱電解質(zhì)組分的離解。如有機酸和有機堿弱離子交換劑：pH影響弱電解質(zhì)組分的離解。如有機酸和有機堿離子交換劑自身的交換容量四、應(yīng)用例Separationofnucleotidesand

relatedcompoundsbyanionexchange五、離子排斥色譜離子排阻色譜離子排阻分配色譜（ionexclusionpartitionchromatography)離子節(jié)制分配色譜（ion-moderatedpartitionchromatography)離子排斥色譜的原理強陽離子交換樹脂與有機酸的作用。由于Donnan電位的存在，使強酸陰離子受阻于樹脂之外，而低電離度的弱酸分子可進入樹脂內(nèi)部，通過與樹脂相互作用得到保留。選擇性：組分受阻程度的不同組分與樹脂功能基的極性相互作用的差異組分與樹脂基體間的非極性相互作用的差異有機酸的分離例六、離子色譜分離原理同離子交換色譜采用低交換容量的固定相低濃度的電解質(zhì)溶液為流動相檢測技術(shù)的改進雙柱離子色譜1975年Small等提出單柱離子色譜Fritz等提出雙柱離子色譜抑制柱中的反應(yīng)R+-OH-+H+Cl-R+-Cl-+H2OR+-OH-+M+Cl-M+OH-+R+-Cl-單柱離子色譜固定相：低交換容量的離子交換劑流動相：采用電導(dǎo)極低的溶液作為流動相，例如10-4mol/mL的苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽稀溶液。單柱離子色譜法中使用的洗脫液陰離子：苯甲酸鹽、氫氧化鈉、甲基磺酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、檸檬酸鹽、水楊酸等陽離子：硝酸、高氯酸、乙二胺硝酸鹽、乙二胺硝酸鹽等單柱離子色譜法的特點應(yīng)用范圍比雙柱法寬靈敏度比雙柱法約低一個數(shù)量級離子色譜法的應(yīng)用無機陰、陽離子，有機離子分析的重要手段一種應(yīng)用廣泛的色譜分析方法環(huán)境科學(xué)、生命科學(xué)、食品科學(xué)等Separationoforganicacidsandinorganicanionsinwine20-7離子對色譜用正相或反相色譜柱分離離子和中性化合物混合物的色譜方法正相離子色譜；反相離子對色譜1970年代中Schill等人將“離子對萃取”原理引入高效液相色譜，建立了離子對色譜法。與離子交換色譜或離子色譜相比柱效高，分離效果好可同時測定離子型化合物和中性化合物反相離子對色譜的分離過程固定相：一般為烷基鍵合硅膠固定相，如ODS原理A+(w)+B-(w)A+B-(o)流動相緩沖溶液離子對試劑有機溶劑（甲醇、乙腈）離子對試劑用于酸性化合物分析：季銨鹽如四甲基銨、四丁基銨叔胺如三辛胺、三庚胺用于堿性化合物分析：烷基磺酸鹽、烷基硫酸鹽高氯酸鹽尿中兒茶酚胺類化合物的分析1.去甲腎上腺素2.腎上腺素3.多巴胺IS:3,4-二羥基苯甲胺固定相：C8流動相：含辛基硫酸鈉的緩沖溶液+甲醇血漿中-酮酸類化合物的分析固定相：C8流動相：含溴化四丙基銨的磷酸鹽緩沖液+ACN20