第九章 酶分子的定向進(jìn)化

第八章酶分子的定向進(jìn)化廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院柯德森第一節(jié)酶分子定向進(jìn)化簡介一.概念:分子定向進(jìn)化：在實(shí)驗(yàn)室試管中模擬達(dá)爾文的自然進(jìn)化原理，對蛋白質(zhì)(酶)的基因利用隨機(jī)突變和隨機(jī)雜交的方法加以改造，通過大規(guī)模篩選，從而得到性能上改良的優(yōu)異變種。使蛋白質(zhì)(酶)在自然界需要幾百萬年才能完成的進(jìn)化過程縮短至幾個(gè)月，為蛋白質(zhì)(酶)的工程應(yīng)用提供了一個(gè)強(qiáng)有力的技術(shù)手段。屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì),它不需要事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制,人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件,模擬自然進(jìn)化機(jī)制(隨機(jī)突變,基因重組和自然選擇),在體外改造酶,并定向選擇(篩選)出所需要性質(zhì)的突變酶.可以促使群體生物大分子向任意功能目標(biāo)進(jìn)化，從而獲得或改良功能大分子?？梢栽趲仔瞧诨驇讉€(gè)月增強(qiáng)基因或蛋白質(zhì)的某種特性，將可用于制造副作用更小的新藥物、營養(yǎng)價(jià)值高的作物品種，或更有益于環(huán)境的化學(xué)加工等等。一.基本原理:合理設(shè)計(jì)與非合理設(shè)計(jì):在比較充分了解酶的結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)上對酶分子進(jìn)行改造,稱為合理設(shè)計(jì);不需要準(zhǔn)確的酶分子結(jié)構(gòu)信息,通過隨機(jī)突變,基因重組,定向篩選等方法對其進(jìn)行改造,稱為酶分子的非合理設(shè)計(jì).非合理設(shè)計(jì)實(shí)用性較強(qiáng),往往可以通過隨機(jī)產(chǎn)生的突變改進(jìn)酶的特性.其基本技術(shù)手段:易錯(cuò)PCR,DNA重組,高突變菌株等技術(shù).達(dá)爾文進(jìn)化所有自然界存在的酶均是基于自然選擇的達(dá)爾文進(jìn)化的產(chǎn)物。受自然界中成就的啟發(fā)，科學(xué)家們開始掌握和應(yīng)用這一進(jìn)化理論，在實(shí)驗(yàn)室中完成達(dá)爾文進(jìn)化，這不僅包括生物機(jī)體與細(xì)胞水平，還包括在單個(gè)的生物大分子水平上。達(dá)爾文進(jìn)化主要包括重復(fù)進(jìn)行的三個(gè)過程：選擇、擴(kuò)增和變異

選擇，不管是自然的或人工的，均是一個(gè)從“不富有者(thehave-nots)”群體中分離“富有者(thehavesorthefecund)”的揚(yáng)棄過程。在實(shí)驗(yàn)室中，富有者則是那些能滿足實(shí)驗(yàn)人員所附標(biāo)準(zhǔn)要求的分子。擴(kuò)增，就是產(chǎn)生子代；更確切地說，就是備份遺傳基因。在實(shí)驗(yàn)室中，實(shí)驗(yàn)人員將選擇與擴(kuò)增關(guān)聯(lián)，僅使那些能滿足所附標(biāo)準(zhǔn)要求者產(chǎn)生子代。確切地說，不是所選分子本身，而是它們的基因被擴(kuò)增。變異，就是引入變種。定向分子進(jìn)化的功效在于巨大數(shù)量的力量和分子多樣性。二、天然酶分子雖然已經(jīng)進(jìn)化了千百萬年,但仍然蘊(yùn)藏著具大的發(fā)展空間:天然酶在生物體內(nèi)存在環(huán)境與酶的實(shí)際應(yīng)用環(huán)境不同.因此提供了在實(shí)際環(huán)境中的巨大的進(jìn)化空間;自然的選擇壓力是酶分子與各種生物分子之間協(xié)調(diào)作用,以適應(yīng)周圍環(huán)境的需要,而實(shí)際應(yīng)用中總是希望該酶活力和穩(wěn)定性越高越好.自然的選擇壓力更多地是體現(xiàn)在更好地調(diào)節(jié)能力,而不是活性和穩(wěn)定性的提高;當(dāng)人為創(chuàng)造需要高活力和高穩(wěn)定性的選擇壓力時(shí),就可能使酶向相應(yīng)的目標(biāo)進(jìn)化;第二節(jié)定向進(jìn)化的策略易錯(cuò)PCR:使用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因時(shí),通過調(diào)整反應(yīng)條件,例如提高M(jìn)g2+濃度,加入Mn2+,改變體系中四種dNTP的濃度等,改變Taq酶的突變頻率,從而向目的基因中,以一定的頻率隨機(jī)引入突變構(gòu)建突變庫然后選擇或篩選需要的突變體.連續(xù)易錯(cuò)PCR:即將一次PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板,連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘變,使每一次獲得的小突變積累而產(chǎn)生重要的有益的突變.第二節(jié)定向進(jìn)化的策略DNA改組技術(shù):是一種有性PCR,將已經(jīng)獲得的存在于不同基因中的正突變結(jié)合在一起組成新的突變基因庫.其基本的操作過程是從正突變基因庫中分離出來的DNA片段用脫氧核糖核酸酶I隨機(jī)切割,得到的隨機(jī)片段經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán),隨機(jī)引物片段之間互為模板和引物,直到獲得全長的基因,這導(dǎo)致來自不同基因片段之間的重組.該策略將來自親本基因中的優(yōu)勢突變盡可能地組合在一起,在理論上優(yōu)于連續(xù)的易錯(cuò)PCR等無性進(jìn)化的策略.定向進(jìn)化的選擇策略:篩選的方法必須靈敏,至少與目的性質(zhì)相關(guān);篩選的方法必須有明顯的可供測量的信號;選擇的標(biāo)準(zhǔn)必須是合乎研究目的的指標(biāo)突變體的構(gòu)建及應(yīng)用(一)構(gòu)建理想基因文庫要考慮的因素:1.基因文庫的質(zhì)量:文庫的代表性和突變基因片段的完整性文庫的代表性:指文庫包含的DNA分子是否能完整地反映出來源基因的全部可能的變化和改變,是體現(xiàn)文庫質(zhì)量的最重要指標(biāo);突變基因的完整性:突變DNA片段應(yīng)盡可能地完整反映出基因的結(jié)構(gòu).(二)構(gòu)建突變文庫的載體系統(tǒng):優(yōu)缺點(diǎn)1.噬菌體載體系統(tǒng):優(yōu)點(diǎn)為可以裝載容量大的,適合于大片段的克隆.較好的質(zhì)量控制;缺點(diǎn):可采用的文庫篩選方法有限,常常在載體系統(tǒng)中無法表達(dá).2.質(zhì)粒載體系統(tǒng):操作方便,可塑性強(qiáng),能夠?qū)崿F(xiàn)對基因文庫的功能篩選.缺點(diǎn):插入片段的容量較小.(二)構(gòu)建突變文庫的載體系統(tǒng):優(yōu)缺點(diǎn)3.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng):是一個(gè)新動(dòng)向,已顯示了良好的前景.文庫的篩選策略:兩種基本策略:根據(jù)已知基因編碼產(chǎn)物的特定活性進(jìn)行篩選.這種方法可以很直觀快速地檢出有效突變的基因.但需要有比較直觀和明顯的生物學(xué)檢定形狀的出現(xiàn).不需要附加任何條件,通過檢測在特定條件下來源于兩個(gè)文庫的基因編碼產(chǎn)物之間發(fā)生相互作用的情況,從而確定這兩個(gè)文庫中的所有可能在生理上發(fā)生相互作用的基因?qū)?描繪出某一特定類型細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出基因之間發(fā)生的基因相互作用聯(lián)絡(luò)圖.2.篩選方法:基于基因編碼蛋白質(zhì)的檢測篩選表達(dá)文庫:前提條件是文庫中的基因必須在宿主細(xì)胞中獲得功能性表達(dá).嗜菌體表面展示系統(tǒng):是通過體外富集策略進(jìn)行基因文庫篩選的一種具體方法;酵母雙雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng):酵母雙雜交系統(tǒng)雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。80年代的工作表明,轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular),即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,簡稱為DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain,簡稱為AD),它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨(dú)的DB雖然能和啟動(dòng)子結(jié)合,但是不能激活轉(zhuǎn)錄。而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。如酵母細(xì)胞的Gal4蛋白的DB與大腸桿菌的一個(gè)酸性激活結(jié)構(gòu)域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結(jié)合到Gal4結(jié)合位點(diǎn)并激活轉(zhuǎn)錄。

Fields等人的工作標(biāo)志雙雜交系統(tǒng)的正式建立。他們以與調(diào)控SUC2基因有關(guān)的兩個(gè)蛋白質(zhì)Snf1和Snf2為模型,將前者與Gal4的DB結(jié)構(gòu)域融合,另外一個(gè)與Gal4的AD結(jié)構(gòu)域的酸性區(qū)域融合。由DB和AD形成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌”(bait)和“獵物”或靶蛋白(preyortargetprotein)。如果在Snf1和Snf2之間存在相互作用,那么分別位于這兩個(gè)融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子,從而激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。這個(gè)被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”相互作用的基因稱之為報(bào)道基因(reportergene)。通過對報(bào)道基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測,反過來可判別作為“誘餌”和“獵物”的兩個(gè)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。在此Fields等人采用編碼β-半乳糖苷酶的LacZ作為報(bào)道基因,并且在該基因的上游調(diào)控區(qū)引入受Gal4蛋白調(diào)控的GAL1序列。這個(gè)改造過的LacZ基因被整合到酵母染色體URA3位上。而酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的負(fù)調(diào)控因子)被缺失,從而排除了細(xì)胞內(nèi)源調(diào)控因子的影響。已經(jīng)知道在Snf1和Snf2之間存在相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有同時(shí)轉(zhuǎn)化了Snf1和Snf2融合表達(dá)載體的酵母細(xì)胞才有β-半乳糖苷酶活性,單獨(dú)轉(zhuǎn)化其中任何一個(gè)載體都不能檢測出β-半乳糖苷酶活性。

目前發(fā)展起來的各種雙雜交系統(tǒng)大多是以Fields等人建立的系統(tǒng)為基礎(chǔ)的。這些新系統(tǒng)主要對報(bào)道基因、“誘餌”表達(dá)載體以及“獵物”表達(dá)載體等做了一些改進(jìn)。其中一個(gè)重要改進(jìn)是引入額外的報(bào)道基因,如廣泛采用的HIS3基因。經(jīng)過改造帶有HIS3報(bào)道基因的酵母細(xì)胞,只有當(dāng)HIS3被啟動(dòng)表達(dá)才能在缺乏組氨酸的選擇性培養(yǎng)基上生長。HIS3報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是由“誘餌”和“獵物”的相互作用所啟動(dòng)的。大多數(shù)雙雜交系統(tǒng)往往同時(shí)使用兩個(gè)甚至三個(gè)報(bào)道基因,其中之一是LacZ。這些改造后的基因在啟動(dòng)子區(qū)有相同的轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合位點(diǎn),因此可以被相同的轉(zhuǎn)錄激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活。通過這種雙重或多重選擇既提高了檢測靈敏度又減少了假陽性現(xiàn)象。其他還有針對“誘餌”或“獵物”表達(dá)載體等所作的改進(jìn),這里不一一詳述。

在雙雜交鑒定過程中要經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)化,這個(gè)工作量是相當(dāng)大的,特別是尋找新的作用蛋白質(zhì)的時(shí)候尤其如此。而且,酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率比細(xì)菌要低約4個(gè)數(shù)量級。因此轉(zhuǎn)化步驟就成為雙雜交技術(shù)的瓶頸。Bendixen等人通過酵母接合型的引用,避免了兩次轉(zhuǎn)化操作,同時(shí)又提高了雙雜交的效率。在酵母的有性生殖過程中涉及到兩種配合類型：a接合型和α接合型,這兩種單倍體之間接合(mating)能形成二倍體,但a接合型細(xì)胞之間或α接合型細(xì)胞之間不能接合形成二倍體。根據(jù)酵母有性生殖的這一特點(diǎn),他們將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化α接合型酵母細(xì)胞,“誘餌”表達(dá)載體轉(zhuǎn)化a接合型細(xì)胞。然后分別鋪篩選平板使細(xì)胞長成菌苔(lawn),再將兩種菌苔復(fù)印到同一個(gè)三重篩選平板上,原則上只有誘餌和靶蛋白發(fā)生了相互作用的二倍體細(xì)胞才能在此平板上生長。單倍體細(xì)胞或雖然是二倍體細(xì)胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。長出來的克隆進(jìn)一步通過β-半乳糖苷酶活力進(jìn)行鑒定。這項(xiàng)改進(jìn)不僅簡化了實(shí)驗(yàn)操作,而且也提高了雙雜交的篩選效率。

在研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)、作用方式過程中,有時(shí)還要通過突變、加抑制劑等手段破壞蛋白質(zhì)間的相互作用。針對實(shí)際工作中的這種需要,Vidal等人發(fā)展了所謂的逆雙雜交系統(tǒng)(reversetwo-hybridsystem)。這項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵是報(bào)道基因URA3的引入。URA3基因在這里起到了反選擇的作用,它編碼的酶是尿嘧啶合成的關(guān)鍵酶。該酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)轉(zhuǎn)化成對細(xì)胞有毒的物質(zhì)。Vidal等人通過改造在URA3基因的啟動(dòng)子內(nèi)引入Gal4的結(jié)合位點(diǎn)。這個(gè)改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的選擇性培養(yǎng)基上只有當(dāng)“誘餌”和“獵物”相互作用激活URA3基因的表達(dá)才能生長。在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上“誘餌”和“獵物”的相互作用則抑制細(xì)胞的生長。然而如果目的蛋白,即與DB或AD融合的蛋白質(zhì)發(fā)生了突變或者由于外加藥物的干擾不再相互作用,URA3基因不表達(dá),則細(xì)胞能在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上生長。通過這種方法，Vidal等人篩選到了轉(zhuǎn)錄因子E2F1的突變物,這些突變物仍然能結(jié)合視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白RB,但是喪失了同另外一種稱為DP1蛋白的結(jié)合能力。結(jié)果得到了體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。通過對這些突變蛋白基因的測序,他們發(fā)現(xiàn)了新的E2F1同DP1結(jié)合的位點(diǎn)。酵母單雜交(yeastonehybrid)酵母單雜交(yeastonehybrid)技術(shù)是體外分析DNA與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的一種方法，通過對酵母細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因表達(dá)狀況的分析，來鑒別DNA結(jié)合位點(diǎn)并發(fā)現(xiàn)潛在的結(jié)合蛋白基因，或?qū)NA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析.運(yùn)用此技術(shù)，能篩選到與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，并可直接從基因文庫中得到編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列，而無需復(fù)雜的蛋白質(zhì)分離純化操作，故在蛋白研究中，具有一定的優(yōu)勢；而且，酵母屬真核細(xì)胞，通過酵母系統(tǒng)得到的結(jié)果比其他體外技術(shù)獲得的結(jié)果更能體現(xiàn)真核細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的真實(shí)情況.

酵母單雜交技術(shù)的原理酵母單雜交技術(shù)最早是1993年由Lietal[1,2]從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來，酵母雙雜交技術(shù)通過對報(bào)告基因的表型進(jìn)行檢測以實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)間相互作用的研究[3-6]，而酵母單雜交技術(shù)則通過對報(bào)告基因的表型檢測，分析DNA、蛋白之間的相互作用，以研究真核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控.

目前認(rèn)為真核生物的轉(zhuǎn)錄起始需要轉(zhuǎn)錄因子的參與.這些轉(zhuǎn)錄因子通常由一個(gè)DNA特異性結(jié)合功能域和一個(gè)或多個(gè)與其他調(diào)控蛋白相互作用的激活功能域組成，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain,BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain,AD).用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子.研究[2]表明GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端,含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS);而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性.在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用.據(jù)此，我們可將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為其他蛋白，只要他能與我們想要了解的目的基因相互作用，就照樣可以通過其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，從而啟動(dòng)對下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄.正是基于這一理論，酵母單雜交系統(tǒng)由2部分組成：(1)將文庫蛋白片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫質(zhì)粒；(2)含有目的基因和下游報(bào)告基因的報(bào)告質(zhì)粒.在實(shí)驗(yàn)中,首先將報(bào)告質(zhì)粒整合入酵母基因組,產(chǎn)生帶有目的基因的酵母報(bào)告株;再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入報(bào)告株;若存在文庫蛋白與目的基因的相互作用,可通過對報(bào)告基因的表達(dá)將文庫蛋白的基因篩選出來.

酵母單雜交技術(shù)的應(yīng)用酵母單雜交技術(shù)是建立在許多真核轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)構(gòu)和功能上是由獨(dú)立的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和DNA激活結(jié)構(gòu)域組成的基礎(chǔ)上，這使得研究者可以構(gòu)建不同的基因融合體，在酵母中表達(dá)融合蛋白，以同時(shí)結(jié)合特異的目的基因和激活轉(zhuǎn)錄.理論上，在酵母單雜交技術(shù)中，任何目的基因都可捕獲能與目標(biāo)因子特異結(jié)合的蛋白[2].酵母單雜交技術(shù)應(yīng)用歸納為以下二類:2.1鑒別DNA結(jié)合位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)潛在的結(jié)合蛋白基因目前對于酵母單雜交技術(shù)的應(yīng)用主要體現(xiàn)在這方面.Chewetal[7]應(yīng)用酵母單雜交技術(shù)證實(shí)了在大鼠腦中存在的COUP-TFⅠ、EAR2和NURR1等蛋白質(zhì)是GRIK5基因的內(nèi)含子結(jié)合蛋白，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了多種核孤兒受體可通過與內(nèi)含子序列結(jié)合發(fā)揮其調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)受體基因作用的假設(shè).Weietal[8]1999年運(yùn)用此技術(shù)確定了特異性結(jié)合于海膽胚胎孵化酶(SpHE)基因調(diào)控區(qū)域的反式激活因子SpEst4.Siewekeetal[9]運(yùn)用酵母單雜交技術(shù)對轉(zhuǎn)錄輔助因子進(jìn)行了篩選.Huangetal[10]為分離與人ε-珠蛋白基因上游沉默子片段相互作用的蛋白，運(yùn)用酵母單雜交技術(shù)，利用人肝cDNA文庫進(jìn)行篩選，得到能與其結(jié)合的蛋白RPL3(ribosomalproteinL3),并通過電泳遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)(EMSA)和競爭抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)其確有結(jié)合該沉默子活性,進(jìn)而說明RPL3通過與人ε-珠蛋白基因上游沉默子結(jié)合，在胚胎階段的沉默人ε-珠蛋白基因表達(dá)中扮演了重要角色.Liaoetal[11]于2002年運(yùn)用酵母單雜交技術(shù)篩選出了能與大鼠谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)P增強(qiáng)子GPEⅠ核心序列相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，經(jīng)對2個(gè)陽性克隆pYGPE1和pYGPE2的鑒定發(fā)現(xiàn)pYGPE1的插入片段與大鼠原癌基因c-juncDNA具有99%同源性，其編碼的氨基酸殘基序列與大鼠c-jun蛋白具有100%同源性，pYGPE2的插入片段與大鼠線粒體腺苷酸轉(zhuǎn)位酶cDNA具有99%同源性,其編碼的氨基酸序列與大鼠腺苷酸轉(zhuǎn)位酶具有100%同源性，并由此得出結(jié)論c-jun蛋白和線粒體腺苷酸轉(zhuǎn)位酶可能是作用于GPEⅠ的反式激活因子.2.2對DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析如果能得到DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)信息,就可以用酵母單雜交技術(shù)對該結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[2].早在1993年，就有人[12,13]用酵母單雜交技術(shù)對2個(gè)不同的鋅指蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析.Lisowskyetal[14]在1999年使用酵母單雜交技術(shù)，利用一個(gè)“GC”富集區(qū)序列篩選出一種新的具有轉(zhuǎn)錄激活活性的鋅指蛋白，由于其結(jié)合的序列富含“GC”，故命名為GC-box結(jié)合蛋白.Maketal[15]運(yùn)用此技術(shù)測試哺乳動(dòng)物具有基本的螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,通過對肌調(diào)節(jié)因子4(MRF4)的研究，證實(shí)其具有轉(zhuǎn)錄活性，并進(jìn)一步證明運(yùn)用酵母單雜交技術(shù)能在哺乳動(dòng)物cDNA文庫中篩選出與E-boxDNA相互作用的新的bHLH蛋白.Nishiyamaetal[16]運(yùn)用酵母單雜交技術(shù)并結(jié)合點(diǎn)突變方法對轉(zhuǎn)錄活性片段Elf-1進(jìn)行分析，確定具有轉(zhuǎn)錄活性的區(qū)域位于第87-175堿基區(qū).存在問題及解決辦法3.1在鑒別DNA結(jié)合位點(diǎn)中存在的缺陷由于細(xì)胞技術(shù)的先天局限性,即影響因子多，因此，可能有內(nèi)源性的酵母表達(dá)激活物與DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,并激活報(bào)告基因的表達(dá)，則相應(yīng)的目的基因片段可能因此而被漏檢.這個(gè)問題在試圖鑒定某基