純化層析介質培訓

純化層析介質培訓2015.10序言根據生物分子特性特性的差異，使用純化技術分離純化生物分子：分子特性純化技術生物性識別親和層析電荷離子交換層析疏水性疏水層析反相層析分子大小凝膠過濾層析色譜純化的分離原理EPO純化使用的層析介質

填料名稱生產廠家親和層析BlueSepharose6FastFlowGE超濾Biomax8Millipore離子交換層析IDEAESepharoseFastFlowGE反相層析OligoR3AppliedBiosystems離子交換層析IIDEAE-SepharoseFastFlowGE凝膠過濾層析SephacrylS-200HRGE親和層析介質什么是親和層析?親和層析是通過生物分子的生物相互作用進行生物分子分離的一項液相分離技術?；靖拍睿禾禺愋越Y合典型的生物間相互作用親和介質的組成基質：用于吸附配基?；|應該具有化學惰性和物理學惰性。間隔臂：通過克服任何空間位阻效應，提高基質和目標分子的結合。配基：能夠可逆的結合特定目標分子或者目標分子基團的分子EPO生產中的親和層析介質名稱BlueSepharose6FastFlow基質Sepharose（瓊脂糖凝膠）配基CibacronBlue3G（辛巴藍）藍膠的光學顯微鏡照高效的色譜基質具有理化惰性具有相當?shù)偷姆翘禺愋晕教菤埢系牧u基基團容易被衍生化，可以使配基共價附著在上面具有開放的孔狀結構，保證高容量結合具有良好的流動特性，適于快速分離在實驗所需的條件范圍內具有穩(wěn)定性，例如高和低的pH值、去污劑和裂解試劑Sepharose瓊脂糖凝膠Sepharose是一種小球形狀的瓊脂糖，具有上述的特性瓊脂糖的部分結構配基配基是可以可逆結合特定分子或者分子基團的分子。配基與目標物的結合必須具有特異性和可逆性，并且必須具有化學修飾基團，可以使它吸附在基質上，并且不損害它的活性。配基脫落問題藍膠配基藍膠非特異性結合：具有基本右手螺旋的蛋白質，包括白蛋白、EPO等，都可以結合。這一結構類似于5’AMP，有親和層析的效果——NDP依賴脫氫酶和ATP依賴激酶。含有SO3Na，會形成離子鍵。含有大量苯環(huán)結構，形成疏水鍵。SepharoseNNNHSO3NaSO3NaNH2SO3NaNHOOONHNBlueSepharose6FastFlow親和層析介質特性

(BlueSepharose6FastFlow)Totalbindingcapacity>18mghumanserumalbumin/mldrainedmediumLiganddensityapprox.7μmolCibacronBlue3G/mldrainedmediumAverageparticlesize90μm(45to165μm)Beadstructure6%highlycross-linkedagaroseLinearflowvelocity300cm/h(25°C,XK50/30column,15cmbedheight)pHstabilitylongtermshortterm(CIP)4to123to13Chemicalstability7daysat40°Cin70%ethanol6Mguanidinehydrochloride8MUreaTemperaturestability4°Cto40°CAutoclavable121°Cfor15minindistilledwater？為什么用300目篩布目數(shù)，就是孔數(shù)，就是每平方英寸上的孔數(shù)目。目數(shù)越大，孔徑越小。一般來說，目數(shù)×孔徑（微米數(shù)）＝15000由于存在開孔率的問題，也就是因為編織網時用的絲的粗細的不同，不同的國家的標準也不一樣，目前存在美國標準、英國標準和日本標準三種，其中英國和美國的相近，日本的差別較大。我國使用的是美國標準，也就是可用上面給出的公式計算。300目篩布的孔徑為48μm左右200目篩布的孔徑為75μm左右超濾系統(tǒng)什么是超濾？截留分子量1kD-1000kD

膜孔徑0.001-0.10μm切向流過濾（TFF）過濾方式普通過濾(NFF)切向流過濾(TFF)濾芯形式或“死端過濾”流向是垂直于過濾介質的

所有的液體全部透過過濾介質

顆粒被截留在過濾膜內部或表面交叉流動過濾

流向是切向(平行)于過濾膜表面的一小部分液體透過過濾介質截留的顆粒從膜的表面被”掃除””普通過濾(死端過濾)液體流向膜表面濃差極化切向流過濾(錯流過濾)切向流速溶液濃度Cb膜表面膜表面濃度Cw超濾操作回流液虹吸補液調節(jié)閥泵超濾膜透過液？問題超濾是根據分子量大小進行分離的，我們實際使用8KD的超濾膜，而EPO蛋白的分子量為30.4KD，我們?yōu)槭裁床贿x用30KD的膜進行超濾？超濾膜截留分子量截留分子量（MWCO:molecularweightcutoff）是使用分子量大小表示的超濾膜的截留性能。如膜對被截留物質的截留率大于90％時，就用被截留物質的分子量表示膜的截留性能超濾膜截留分子量KD%水通量（NWP)用于測試超濾膜的清洗效果水通量：指單位壓力下，單位時間通過單位膜面積的水的體積或質量簡稱：NWP，單位是：升/平米/小時/巴，即單位膜面積，單位壓力下通過膜的水的流量：

NWP=水流量X溫度校正因子/TMP/膜面積

其中膜穿透壓力TMP=（Pin+Pout）/2-Pp，即進口壓力加出口壓力的平均值減去濾過液壓力。水通量（NWP)R=透過速度ml/minPin=進口壓psi(bar)Pout=出口壓psi(bar)Pp=透過口壓psi(bar)T=水溫°CF

=NWP水溫校正因素NWP=R×FA×Pin+Pout

2－Pp水通量（NWP)當膜堆使用了一次之后，所測出的NWP不應低于最初標準的80％；在反復使后，每次NWP的衰減不應超過10％。如果NWP衰減幅度較大，說明清洗效果不好，應該試用其它的清洗劑和清洗程序。超濾膜特性

（Biomax8）截留分子量8KD膜面積0.5m2處理量2L或更大膜材質聚醚砜離子交換層析介質什么是離子交換層析？離子交換層析：是根據蛋白質所帶電荷的差異進行分離純化的一種方法。平衡上樣低鹽高鹽再生陰離子交換層析原理圖陰離子交換層析原理圖離子交換層析I依靠離子強度逐步增強，對蛋白進行分離純化DEAE骨架+OH-目標蛋白-Cl-離子交換層析II利用蛋白的等電點特性，在相同的溶液環(huán)境中電荷性質及數(shù)量不同，對蛋白進行分離純化DEAE骨架+OH-目標蛋白-H+兩性電解質不同蛋白質在特定pH值下的帶電特性離子取代順序電荷高者離子大者濃度大者>+++>++++++>+++離子交換層析介質的類型按活性功能基團帶電荷性質不同膠體-++++++++++++膠體+------------陽離子交換劑陰離子交換劑帶負電荷與陽離子交換帶正電荷與陰離子交換強離子交換劑與弱離子交換劑功能團是否參與電荷的平衡載量是否隨pH值變化較大載量在很寬的pH范圍內保持恒定；其功能團就象是強酸強堿鹽，如果將強陰離子膠放在某一個緩沖液中，使用0.1NaOH去滴定，見下圖（Q和SP），則因為強酸強堿鹽的功能團不會參與電荷的平衡，所以其pH變化直接由0.1NaOH決定，pH直接變化到很高。載量隨

pH

而變化；其功能團就象是弱酸弱堿鹽，0.1NaOH去滴定時，見下圖（DEAE和CM），則因為弱酸弱堿鹽的功能團會解離，參與電荷的平衡，所以表現(xiàn)為有一定的緩沖能力，pH緩慢變化。強離子交換劑弱離子交換劑強離子交換劑與弱離子交換劑強離子交換劑弱離子交換劑可引入的解離基團陽離子交換劑陰離子交換劑磺酸基-SO3-H+季胺基團[-N+(CH3)3]磷酸根-O-PO2H2亞磷酸根-O-POH2叔胺、仲胺、伯胺基團強酸型中等酸型羧基-COOH弱酸型強堿型弱堿型離子交換層析介質特性

（DEAESepharoseFastFlow）是一種弱陰離子交換介質離子交換基團為二乙基氨乙基（diethylaminoethylgroup，即DEAE）：-OCH2CH2N+(CH2CH3)2離子交換層析介質特性

（DEAESepharoseFastFlow）IonexchangetypeWeakanionTotalionic