溫度和ph對(duì)小丑魚消化酶活性的影響

溫度和ph對(duì)小丑魚消化酶活性的影響

研究魚類胃腸道各部分的消化酶活性，是了解魚類消化生理的重要內(nèi)容之一。它對(duì)了解魚類的營(yíng)養(yǎng)成分的特點(diǎn)，改進(jìn)魚類的飼養(yǎng)方法，降低飼養(yǎng)成本具有重要意義。消化酶活性與魚類攝食和生理具有密切的關(guān)系,而溫度和pH是影響消化酶活性重要的因素。目前,國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)魚類消化酶的研究進(jìn)行了報(bào)道。Ribeir等研究了塞內(nèi)加爾鰨幼魚消化酶活性的最適溫度和pH。倪壽文等研究了草魚(Ctenopharyngodonidella)鯉魚(Cyprinuscarpio)、鰱魚(Hypophthalmichthysmolo-trix)、鳙魚(Aristchthysnobilis)、羅非魚(Tilapianilotica的肝胰臟和腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活性及pH值。沈文英研究報(bào)道了銀鯽(Carassiusauratus)的消化酶活性與pH值的關(guān)系。壽建昕等研究了翹嘴紅鲌(Erythroculterilishaefoumis)消化道內(nèi)主要消化酶的最適溫度和pH值。公子小丑魚(Amphiprionocellaris)隸屬于鱸型目(Perciformes)、雀鯛科、?？~亞科、雙鋸魚屬,其外觀美麗,是一種重要的熱帶珊瑚礁觀賞性魚類。美國(guó)以及東南亞地區(qū)對(duì)于小丑魚類的繁殖技術(shù)已較成功,并進(jìn)行了商業(yè)化生產(chǎn)。我國(guó)廣州、上海、溫州等地對(duì)其也成功進(jìn)行了人工繁殖,并有一定數(shù)量進(jìn)入商業(yè)化市場(chǎng)。王斌等報(bào)道了眼斑雙鋸魚的人工繁育技術(shù),滕力平等研究了二線小丑魚的人工繁殖,鮑鷹等研究報(bào)道了紅小丑的人工繁殖和育苗。雖然對(duì)于小丑魚類的繁殖發(fā)育以及生長(zhǎng)等已有較多的研究和實(shí)踐,但有關(guān)公子小丑魚消化酶活性影響的研究尚未見報(bào)道。因此,本研究首次對(duì)公子小丑魚幼魚胃、肝臟、腸道消化酶活性進(jìn)行了測(cè)定,并討論了pH和溫度對(duì)酶活性的影響,更精確地反映了其食性,以期為了解公子小丑魚的消化生理特點(diǎn)和人工配合餌料的研制提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1魚類健康無病試驗(yàn)所用公子小丑魚幼魚取自上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院養(yǎng)殖中心,魚體健康無病,攝食正常。共挑選幼魚45尾,體重1.50(±0.31)g、體長(zhǎng)3.91(±0.35)cm。1.2消化酶活性測(cè)定1.2.1溫度設(shè)置以5℃為梯幅,3種消化酶活性測(cè)定的溫度范圍為20~45℃,共設(shè)6個(gè)梯度,分別是20、25、30、35、40、45℃。在試驗(yàn)測(cè)定中其他條件和環(huán)境不變,溫度由恒溫水浴鍋控制。1.2.2pH設(shè)置胃蛋白酶活性測(cè)定采用檸檬酸-磷酸鹽緩沖體系,其他采用磷酸鹽緩沖體系。胃蛋白酶活性測(cè)定pH值范圍為2.0~3.0和6.0~8.0,梯幅分別為0.2和0.5,共設(shè)11個(gè)梯度。胃淀粉酶、脂肪酶和肝臟和腸道消化酶活性測(cè)定pH值范圍為6.0~8.0,梯幅為0.5,共設(shè)5個(gè)梯度。在測(cè)定中其他條件和環(huán)境不變。1.2.3粗酶液制備粗酶液的制備方法參照尹彥強(qiáng)所用方法,并稍作修改。將公子小丑魚放置于冰盤上解剖,取胃、肝臟、腸道并剔除附著物,用最小感量(0.1mg)電子天平精確稱重。將所取待測(cè)組織裝入5mL滅菌凍存管中,立即冷凍。隨后加入樣品體積約10倍重pH7.0雙蒸水,在4℃下使用高速勻漿機(jī)勻漿,置于4℃冰箱保存20~28h后,使粗酶提取液盡可能溶解,采用高速冷凍離心機(jī)離心(6000r/min,10min),收集上清液并置于4℃冰箱保存,24h內(nèi)檢測(cè)酶活力。1.2.4酶活性測(cè)定采用Folin-酚顯色法測(cè)定蛋白酶活性,采用3,5二硝基水楊酸顯色法測(cè)定淀粉酶活性,采用以聚乙烯醇橄欖油為底物的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定法測(cè)定脂肪酶活性。1.3數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0和MicrosoftExcel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果與分析2.1溫度對(duì)材料活性的影響2.1.1溫度對(duì)蛋白酶活性的影響溫度對(duì)蛋白酶活性的影響結(jié)果(圖1)顯示,在20~45℃范圍內(nèi),公子小丑魚胃、肝臟和腸道蛋白酶的最適溫度均為40℃。胃蛋白酶活性明顯高于肝臟和腸道,活性大小順序?yàn)槲?gt;前腸>中腸>后腸>肝臟。在20~40℃范圍內(nèi),胃、肝臟和腸道蛋白酶活性均隨溫度升高而增加,在40℃達(dá)到最大,超過40℃時(shí)活性均隨之下降,其中后腸和肝臟變化趨勢(shì)相對(duì)緩和。這表明溫度對(duì)公子小丑魚胃蛋白酶影響遠(yuǎn)大于肝臟和腸道。2.1.2溫度對(duì)淀粉酶活性的影響溫度對(duì)淀粉酶活性的影響結(jié)果(圖2)顯示,在20~45℃范圍內(nèi),公子小丑魚胃淀粉酶的最適溫度為40℃,肝臟淀粉酶的最適溫度為35℃,前腸、中腸和后腸淀粉酶的最適溫度均為30℃,活性明顯?；钚源笮№樞?yàn)榍澳c>中腸>肝臟>后腸>胃。前腸、中腸和后腸淀粉酶活性均在30~45℃之間變化顯著,胃淀粉酶活性在20~40℃之間變化相對(duì)較小,各部位在40℃以上活性較低。這表明腸道和肝臟淀粉酶活性受溫度影響較大,而胃淀粉酶活性受溫度影響較小。2.1.3溫度對(duì)脂肪酶活性的影響圖3顯示,在20~45℃范圍內(nèi),胃、肝臟、前腸、中腸和后腸脂肪酶的最適溫度均為40℃?；钚源笮№樞?yàn)槲?gt;前腸>中腸>后腸>肝臟。各部位脂肪酶活性在20~35℃之間變化趨勢(shì)緩和,活性較低,而在35~45℃之間變化趨勢(shì)顯著,活性明顯。這表明較高的反應(yīng)溫度對(duì)脂肪酶活性影響較大。2.2ph對(duì)淀粉酶活性的影響2.2.1pH對(duì)蛋白酶活性的影響pH對(duì)蛋白酶活性的影響結(jié)果見圖4。在pH值為2.0~8.0范圍內(nèi),測(cè)得公子小丑魚胃蛋白酶最適pH值為2.2;在pH值為6.0~8.0范圍內(nèi),測(cè)得肝臟、前腸、中腸和后腸蛋白酶最適pH值分別為7.5、7.0、7.0和8.0,活性大小順序?yàn)槲?gt;前腸>中腸>肝臟>后腸。這表明胃蛋白酶在強(qiáng)酸性環(huán)境下活性最大,而肝臟和腸道蛋白酶在中性和弱堿性下活性較高。2.2.2pH對(duì)淀粉酶活性的影響pH對(duì)淀粉酶活性的影響結(jié)果(圖5)顯示,在pH值為6.0~8.0范圍內(nèi),胃肝臟、前腸、中腸和后腸淀粉酶最適pH值分別為7.06.0、7.0、7.0和7.0,活性大小順序?yàn)榍澳c>中腸>肝臟>后腸>胃。這表明各部位淀粉酶均在弱酸性和中性環(huán)境下發(fā)揮活性,說明pH對(duì)腸道和肝臟影響較大,而對(duì)胃影響不明顯。2.2.3pH對(duì)脂肪酶活性的影響pH對(duì)脂肪酶活性的影響結(jié)果(圖6)顯示,在pH值為6.0~8.0范圍內(nèi),各部位脂肪酶活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)。除肝臟脂肪酶最適pH值為7.0外,胃、前腸、中腸和后腸脂肪酶最適pH值均為7.5,活性大小順序?yàn)榍澳c>肝臟>中腸>胃>后腸,且活性大小相差較小。這表明各部位脂肪酶活性在中性和弱堿性下相對(duì)較高。3結(jié)論和討論3.1消化酶最適溫度的確定溫度對(duì)魚類消化酶活性具有顯著影響,不同酶類因其結(jié)構(gòu)差異,最適溫度不同。在一定的溫度范圍內(nèi)消化酶催化反應(yīng)速度隨著溫度升高而加快,當(dāng)超過最適溫度時(shí),消化酶活性就會(huì)隨之降低或失活。沈文英報(bào)道了澳洲寶石魚蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的最適溫度分別為50、30、35℃。梅景良等研究結(jié)果表明,黑鯛蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的最適溫度分別50、40、30℃。李希國(guó)等在研究黃鰭鯛消化酶中指出,溫度對(duì)胃和腸道蛋白酶活性影響較大。在本試驗(yàn)中,公子小丑魚蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性在不同溫度下顯然不同。其中胃、肝臟、前腸、中腸和后腸蛋白酶和脂肪酶的最適溫度均為40℃,胃淀粉酶的最適溫度為40℃,肝臟淀粉酶最適溫度為35℃,前腸、中腸和后腸淀粉酶的最適溫度均為30℃。3種酶活性的溫度變化趨勢(shì)基本一致,均隨著溫度升高而增加,達(dá)到最適溫度后,隨溫度升高而降低。說明溫度對(duì)公子小丑魚蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶的影響較大。尾崎久雄認(rèn)為,魚類消化酶的最適溫度范圍一般在30~50℃,這與本試驗(yàn)研究結(jié)果基本一致。將消化酶的最適溫度與實(shí)際環(huán)境溫度進(jìn)行比較,蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的最適溫度均高于公子小丑魚棲息的環(huán)境溫度,這是目前研究魚類消化酶最適溫度普遍現(xiàn)象,與葉元土等的研究結(jié)果相符合。由于消化酶最適溫度的測(cè)定是在離體條件下進(jìn)行的,所測(cè)得結(jié)果只是在一定條件下反映消化酶的耐熱程度及溫度對(duì)酶活性的影響規(guī)律。3.2ph值對(duì)生物酶活性的影響魚類消化道內(nèi)的pH在空腹和飽腹時(shí)差異明顯。pH對(duì)魚類消化生理具有顯著的影響,是改變魚類消化酶活性的重要因素之一。消化酶只有在適應(yīng)的pH范圍內(nèi),才能體現(xiàn)其活性。pH一方面能為消化酶提供適宜的酸堿環(huán)境,一方面調(diào)節(jié)食物消化后消化道內(nèi)酸堿度。本試驗(yàn)結(jié)果表明,公子小丑魚不同部位蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的最適pH值有所不同,其胃、肝臟、前腸、中腸和后腸蛋白酶的最適pH值分別為2.2、7.5、7.0、7.0和8.0,公子小丑魚肝臟淀粉酶的最適pH值為6.0,胃、前腸、中腸和后腸淀粉酶的最適pH值均為7.0。胃蛋白酶和肝臟淀粉酶在酸性條件下活性相對(duì)穩(wěn)定,肝臟和腸道蛋白酶與胃和腸道淀粉酶在中性和弱堿性條件下活性較高,胃蛋白酶活性明顯高于肝臟和腸道。李希國(guó)等研究表明,黃鰭鯛胃、肝臟和腸道蛋白酶的最適pH值分別為2.8、7.0和7.4,羅奇等報(bào)道,條石鯛幼魚胃、肝臟和腸道淀粉酶的最適pH值分別為7.6、6.6和6.6,與本研究結(jié)果相近。本研究結(jié)果顯示,公子小丑魚肝臟脂肪酶的最適pH值為7.0,胃、前腸、中腸和后腸脂肪酶均為7.5。Koven等研究報(bào)道了大菱鲆消化道內(nèi)脂肪酶的最適pH值范圍呈中性和弱堿性,陳蘇維研究泥鰍發(fā)現(xiàn),其消化道各部位脂肪酶活性最適pH值均為7.0,這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。因此,在公子小丑魚幼魚養(yǎng)殖實(shí)踐中及時(shí)調(diào)整餌料成分配比和投喂量,保持幼魚生存水體具有穩(wěn)定的pH,以促進(jìn)幼魚生長(zhǎng),提高餌料吸收率,節(jié)約養(yǎng)殖成本。3.3生物酶活性測(cè)定結(jié)果魚類的消化生理與食性具有密切的關(guān)系,食性與消化道結(jié)構(gòu)和消化能力是相適應(yīng)的。一般情況下,肉食性魚類和植食性魚類在消化道方面上的區(qū)別顯著,肉食性魚類相比植食性魚類消化道較短,食物蛋白質(zhì)含量要求較高,消化道內(nèi)蛋白酶活性強(qiáng)于淀粉酶,而植食性魚類消化道內(nèi)食物纖維素等含量較高,淀粉酶活性比較強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,公子小丑魚在適宜的溫度和pH環(huán)境下,消化道各部位蛋白酶活性明顯高于淀粉酶和脂肪酶,并且發(fā)現(xiàn)其消化道相對(duì)較短,公子小丑魚幼魚的比腸長(zhǎng)為0.56(±0.097),介于大鰭鳠Mystumacropterus(比腸長(zhǎng)為0.531±0.061)、鲇SilurusasotuLinnaeus(比腸長(zhǎng)為0.726±0.0087)、黃姑魚Nibealbiflora(比腸長(zhǎng)為0.90±0.066)之間,這說明公子小丑魚是偏肉食性魚類。吳婷婷研究6種淡水魚類指出,雜食性魚類蛋白酶活性介于肉食性與草食性魚類之間,而淀粉酶和脂肪酶與食性的相關(guān)性不明顯Cowey研究認(rèn)為,餌料的成分、種類和特性等對(duì)魚類消化酶活性具有不同的影響。在公子小丑魚養(yǎng)殖過程中適當(dāng)提高餌料成分中蛋白質(zhì)的含量,有利于促進(jìn)魚體的生長(zhǎng)。3.4生物酶活性測(cè)定Sagiv在研究魚類仔稚魚期和幼魚期消化酶時(shí)發(fā)現(xiàn),絕大部分魚類幼魚期消化道內(nèi)各部位消化酶活性明顯并低于成魚。馬燕梅認(rèn)為魚類消化道內(nèi)不同部位蛋白酶具有不同性質(zhì),而胃蛋白酶活性在酸性環(huán)境下較高。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在最適溫度和pH下,公子小丑魚胃蛋白酶