動物營養(yǎng)學(xué) 自由基對動物機體的氧化損傷與抗氧化劑的修復(fù)作用研究

自由基對動物機體的氧化損傷與抗氧化劑的修復(fù)作用研究

徐建雄上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院主要內(nèi)容自由基生物學(xué)概論營養(yǎng)物質(zhì)與自由基的關(guān)系抗氧化劑對氧化損傷的修復(fù)作用氧化應(yīng)激對畜牧業(yè)的危害與干預(yù)展望“高投入、高產(chǎn)出、高效益”

傳統(tǒng)養(yǎng)殖集約化養(yǎng)殖機體免疫力下降易感疫病繁殖性能下降……飼養(yǎng)周期縮短出欄率提高數(shù)量增幅快應(yīng)激背景自由基生物學(xué)理論解釋自由基的研究主要集中醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)領(lǐng)域：自由基與疾病、衰老、抗氧化食品、保健食品1、自由基的概念是指任何包含一個或多個未成對電子并能獨立存在的原子或基團。

自由基生物學(xué)概論常見的自由基有：活性氧(ROS)：氫自由基、超氧陰離子、羥自由基、烷過氧基、烷氧基、氫過氧基、單線態(tài)氧等活性氮(RNS)：在NO合成酶(NOS)的作用下，精氨酸分解為NO。一氧化氮、過氧亞硝酸離子等自由基生物學(xué)概論連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生更多自由基初級自由基次級自由基與生物體有關(guān)的自由基類型自由基生物學(xué)概論2、自由基的產(chǎn)生

（1）產(chǎn)生的主要途徑：酶促反應(yīng)：黃嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶、醛氧化酶、谷胱苷肽還原酶、二氫乳酸脫氫酶等非酶促反應(yīng)：

通過以自由基作為引發(fā)劑啟動引發(fā)的連鎖反應(yīng)自由基生物學(xué)概論2、自由基的產(chǎn)生

（2）其他途徑輻射分解和光化學(xué)作用：如經(jīng)紫外光、X射線或γ射線照射金屬催化反應(yīng)：如過氧化氫同鐵離子反應(yīng)生成羥基自由炎癥等病變過程中，嗜中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞會產(chǎn)生ROS外源性物質(zhì)進入體內(nèi)也會產(chǎn)生大量自由基：如腎上腺素、四氯化碳、乙醇等會誘導(dǎo)機體產(chǎn)生-CCl3和羥自由基日糧中一些營養(yǎng)素的缺乏3、自由基的清除

（1）抗氧化劑-酶類：超氧化物歧化酶(SOD)過氧化氫酶(CAT)谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-Px)（2）抗氧化劑-非酶類：維生素E、維生素C、維生素A、硒、含硫氨基酸、還原型GSH、不飽和脂肪酸等自由基生物學(xué)概論自由基生物學(xué)概論4、自由基的作用

（1）促進作用：參與脂肪加氧酶產(chǎn)物的生成膠原蛋白的合成增強肝臟的解毒作用凝血酶的合成參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化維持正常的氧化代謝過程等4、自由基的作用（2）氧化損傷對DNA的損傷對蛋白質(zhì)的損傷對細(xì)胞膜的損傷自由基生物學(xué)概論·NO·自由基輻射高氧高溫應(yīng)激堿基損傷

活性氧攻擊DNA的靶位點是腺嘌呤與鳥嘌呤的C8，嘧啶的C5與C6雙鍵。①氧自由基直接作用于雙鍵部位，使之獲得一個加合基而改變其結(jié)構(gòu)。②·OH使脫氧核苷脫嘌呤，即自由基可使DNA鏈上出現(xiàn)無嘌呤或無嘧啶部位。③·OH可以自動從胸嘧啶的甲基中除去H原子。——對DNA的損傷DNA鏈斷裂①·OH對DNA的攻擊，主要針對DNA分子中的核糖部分，可能的位置在DNA分子中核糖的3’和4’碳位上，造成DNA鏈的斷裂。②自由基對胸腺嘧啶堿基作用，造成的損害經(jīng)修復(fù)酶切除，可產(chǎn)生類似的單鏈斷裂。③氧化應(yīng)激可啟動細(xì)胞內(nèi)的一系列代謝過程，激活核酸酶，導(dǎo)致DNA鏈的斷裂?！獙NA的損傷自由基對DNA分子各種損傷的示意圖

DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)單鏈斷裂堿基替換堿基丟失雙鏈斷裂氫鏈斷裂DNA-DNA交聯(lián)嘧啶二聚體鏈間斷裂對脂肪族氨基酸氧化損傷最常見的途徑為：在α-位置上將一個氫原子除去，形成C—中心自由基，再加氧其上，生成過氧基衍生物。后者分解成NH3及α-酮酸，或生成NH3、CO2與醛類或羧酸，破壞脂肪族氨基酸的結(jié)構(gòu)。芳香氨基酸很少出現(xiàn)α-除氫，而多出現(xiàn)羥基衍生物。后者可將苯環(huán)打開或在酪氨酸處交聯(lián)成二聚體。由過渡金屬介導(dǎo)出現(xiàn)氧化損傷，主要通過Fenton反應(yīng)。其損傷特點為部位特異性。因為，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)只有某個或幾個金屬結(jié)合部位的氨基酸受到影響。脂質(zhì)過氧化的自由基中間產(chǎn)物作用，如烷氧自由基(LO·)和過氧自由基(LOO·)，可與過氧化脂質(zhì)緊密聯(lián)系的蛋白質(zhì)反應(yīng)?！獙Φ鞍踪|(zhì)的損傷脂質(zhì)過氧化(lipidperoxidation)細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜中含有大量不飽和脂肪酸側(cè)鏈，易被自由基氧化，發(fā)生脂質(zhì)過氧化，對生物膜具有強烈的破壞作用對細(xì)胞膜的損傷判斷機體自由基損傷的程度測定自由基傷害的指標(biāo)：

當(dāng)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA被自由基氧化後，會產(chǎn)生某些特定物質(zhì)，并釋放到血液及尿液中，經(jīng)由抽血、驗?zāi)蚩梢灾兰?xì)胞受傷害的情形。測定自由基釋放量：

利用電子自旋共振光譜儀，或化學(xué)冷光測定，偵測體內(nèi)的自由基。測定抗氧化劑：a.在血液中加入氧化劑，測定自由基的釋放量。b.測定抗氧化劑含量c.抗氧化掃描儀(BiophotonicScanner)：利用雷射光射入電子，利用雷射光射入電子，可測定皮膚下胡蘿卜素，胡蘿卜素是人體重要的抗氧化劑之一。營養(yǎng)物質(zhì)與自由基的關(guān)系1.營養(yǎng)物質(zhì)是自由基產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)氨基酸/蛋白質(zhì)：一氧化氮合酶的生物合成需要氨基酸、核黃素、嘌呤等物質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)與自由基的關(guān)系脂肪酸：攝入過高的PUFA可使機體產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)維生素：通過抑制iNOS基因的表達而抑制NO的產(chǎn)生，如維生素A可抑制心血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和腎細(xì)胞中iNOS基因的表達礦物質(zhì)：Fe2+參與自由基的生成，主要通過催化Fenton反應(yīng),參與氧化酶的構(gòu)成，構(gòu)成自由基反應(yīng)鏈中的電子傳遞系統(tǒng)而起作用。Fenton反應(yīng)可產(chǎn)生毒性很強的·OH。Se:當(dāng)Se缺乏時導(dǎo)致Se-GSH-Px活性降低，其降解體內(nèi)代謝過程產(chǎn)生的內(nèi)源性的H2O2和ROOH能力減弱，引起PUFA過氧化而直接損害膜結(jié)構(gòu)。銅：催化自由基反應(yīng)。氟：·OH和

的產(chǎn)生依賴于氟的濃度；而在高氟時主要產(chǎn)生自由基。O2O22.營養(yǎng)物質(zhì)是動物體內(nèi)清除自由基的物質(zhì)來源氨基酸/蛋白質(zhì)合成酶類抗氧化劑，如谷胱甘肽的生物合成需要氨基酸、礦物元素和ATP的參與。維生素本身是營養(yǎng)物質(zhì)也是體內(nèi)必須的抗氧化劑，如VA、VC、VE、β-類類胡蘿卜素等直接參與ROS的清除以及提高抗氧化物酶活性礦物質(zhì)是酶類抗氧化劑的活化中心，如內(nèi)源硒、銅、錳是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)與超氧化物歧化酶(Cu,Zu-SOD；Mn-SOD)生物合成所必需的微量元素營養(yǎng)物質(zhì)與自由基的關(guān)系3.營養(yǎng)物質(zhì)是自由基所致生物分子損傷修復(fù)的物質(zhì)基礎(chǔ)被損傷的生物分子在修復(fù)或置換的過程中所需要的物質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、脂肪酸、酶系統(tǒng)與輔助因子以及能量來源均以營養(yǎng)物質(zhì)為最終物質(zhì)基礎(chǔ)。飼料中某些天然抗氧化劑及部分非營養(yǎng)素的有效成分可能也直接或間接地在生物分子的修復(fù)或置換過程中起到物質(zhì)基礎(chǔ)的作用。營養(yǎng)物質(zhì)與自由基的關(guān)系4.某些營養(yǎng)物質(zhì)有利于動物適應(yīng)氧化應(yīng)激和防治某些動物疾病日糧提高抗氧化劑（如：維生素C、維生素E）的用量可減小氧化應(yīng)激所造成的危害適宜的營養(yǎng)水平也可以減少和預(yù)防生理性氧化應(yīng)激所造成的損傷。營養(yǎng)物質(zhì)與自由基的關(guān)系TissueDamageandDiseaseProtectionfromDiseaseAntioxidantsFreeradicals自由基穩(wěn)衡理論：

正常情況下，動物機體內(nèi)的自由基是處于不斷的產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡之中?？寡趸瘎ρ趸瘬p傷的修復(fù)作用機體對不同來源的自由基有一系列的防御機制，主要包括如預(yù)防性機制、修復(fù)機制、物理性防御和抗氧化劑預(yù)御等幾種，抗氧化劑通過抑制或減緩自由基的生成來達到修復(fù)機體的氧化損傷有重要的作用抗氧化物質(zhì)主要的作用機制：通過提供活性基團，作為供氫體與自由基反應(yīng)，使之形成相應(yīng)的離子或分子，滅活自由基，終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；提高抗氧化酶活性，降低膜的流動性，從而降低自由基反應(yīng)，達到抑制脂質(zhì)過氧化作用?？寡趸瘎ρ趸瘬p傷的修復(fù)作用酶類抗氧化劑超氧化物歧化酶(SOD)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)過氧化氫酶(CAT)非酶類抗氧化劑VE硒VC新型天然抗氧化劑茶多酚類黃酮中草藥微生物源性抗氧化劑酶類抗氧化劑對各自由基的作用示意圖CATGSH-Px超氧化物歧化酶(SOD)SOD清除的作用機理為Cu/Zn-SOD二聚體的碳鏈走向Fe-SOD模擬三維結(jié)構(gòu)圖Mn-SODN端小結(jié)構(gòu)域O2超氧化物歧化酶是一種能催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的金屬酶，按金屬輔基不同分為三類：谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)它是清除H2O2的另一種酶。GSH-Px是一種含硒酶，它的作用底物是谷胱甘肽（GSH），它在催化GSH轉(zhuǎn)化為氧化形式的谷胱甘肽（GSSG）用掉一個H2O2。該反應(yīng)式為：GSSG+2H2OH2O2+GSH過氧化氫酶(CAT)過氧化氫酶是清除H2O2的一種酶，催化H2O2分解的機理為CAT-Fe(Ⅲ)+H2O2化合物-Ⅰ化合物-Ⅰ+H2O2CAT-Fe(Ⅲ)+2H2O+O2總反應(yīng)式為：2H2O22H2O+O2VE極易受分子氧和自由基氧化，因此可以充當(dāng)抗氧化劑和自由基清除劑，其氧化歷程為：VE硒硒是GSH-Px的輔助因子(GSH-Px含有4個硒原子)，Se-GSH-Px的主要生物學(xué)作用就是清除H2O2和ROOH。VE和硒對自由基損傷雛雞抗氧化能力的影響+VE+硒對照組+VE+硒對照組GSH-PxMDA試驗天數(shù)(a-tocopherol150IU/kgfeedandselenium0.1mg/kgfeed)Sodhi.s,2008

VE+Se+VE-Se+VE+Se-VE-Se-肝臟162.33±10.64Ab180.81±8.84Aa126.91±4.83Bc167.37±7.52Aa心臟168.04±7.08A172.33±9.20A135.18±5.38B176.54±5.95A注：同一行數(shù)據(jù)以不同大寫字表示P<0.01，不同小寫字母表示P<0.05。不同水平VE和Se對肉雞肝臟和心臟NO自由基水平的影響徐建雄，2007徐建雄，2007不同水平VE和Se對肉雞肝臟和血清中SOD酶活力的影響處理時間VE+Se+VE-Se+VE+Se-VE-Se-肝臟（U/mgprot）5天32.49±4.53b32.30±5.57b32.17±4.87b40.28±4.28a10天33.66±0.65Bb28.85±4.97Bc35.8±1.64ABb39.59±0.76Aa15天36.41±0.57a28.84±5.01b32.55±1.27b28.81±4.05b血清（U/ml）5天180.41±5.1B182.63±5.81B201.42±6.3A165.31±6.34C10天182.72±6.08C173.97±8.14D201.11±6.69B202.01±7.53A15天202.81±6.96A158.63±9.77C177.80±5.84B121.34±4.97D徐建雄，2007不同水平VE和Se對肉雞肝臟和血清中GSH-Px酶活力的影響處理時間VE+Se+VE-Se+VE+Se-VE-Se-肝臟（U/mgprot）5天8.59±0.96a8.34±0.90a8.75±0.92a8.19±1.00a10天8.33±0.29B8.63±0.31Ab9.28±0.19Aa8.73±0.84Aa15天11.17±0.44A7.87±0.69BCb8.98±0.58Ba7.48±0.99C血清（U/ml）5天149.89±9.60a170.22±17.95a167.99±14.46a156.16±17.60a10天193.65±4.89Aa170.33±14.32Ab160.37±21.56B176.15±11.73Aab15天269.73±4.53A241.06±22.47B237.88±10.82B223.51±13.65B徐建雄，2007不同水平VE和Se對肉雞肝臟和血清中MDA含量的影響處理時間VE+Se+VE-Se+VE+Se-VE-Se-肝臟（nmol/mgprot）5天1.16±0.065B1.01±0.066C1.15±0.065B1.29±0.066A10天1.18±0.063A1.17±0.066A1.16±0.083A1.22±0.126A15天1.16±0.053C1.46±0.062Ab1.33±0.090B1.57±0.071Aa血清（nmol/ml）5天3.73±0.28a

3.59±0.48a

3.47±0.61a3.88±0.73a

10天3.75±0.48ab

4.06±0.50a3.36±0.33b

4.00±0.32a

15天3.53±0.49B

4.00±0.56B

4.20±0.31Ab

4.89±0.51Aa

徐建雄，2007由于其本身極容易被氧化，能降低介質(zhì)中的含氧量，其氧化并降解過程包括兩個方面：一種是在有氧的條件下，先氧化（提供一個氫）成單氫抗壞血酸、或稱抗壞血酰自由基，進而再氧化成脫氫抗壞血酸。另一種是在無氧條件下，經(jīng)各種中間階段而形成呋喃、2-羥基糠醛等物，這里不存在供氫的過程VCVC對大鼠抗氧化酶活性的影響2.36*(66%)2.18*(20%)VC(12mg/gfeed)1.421.81ControlGSH-Px(U/mgprotein)2.41*(39%)2.26*(26%)VC(12mg/gfeed)1.731.80ControlCatalase(U/mgprotein)1.201.21VC(12mg/gfeed)1.281.10ControlSOD(U/mgprotein)MuscleLiverDietShireenK.F.，2008茶多酚茶多酚是一種多酚類物質(zhì)，含四種單體。它對過氧化氫和超氧陰離子自由基的消除效果優(yōu)于維生素E和C，對細(xì)胞膜等有保護作用，對脂質(zhì)過氧化自由基的消除作用十分明顯。沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG沒食子兒茶素EGC兒茶素EC兒茶素沒食子酸酯