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文檔簡介

根系活力的測定(TTC法)植物根系是活躍的吸收器官和合成器官,根的生長情況和活力水平直接影響地上部的生長和營養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水本。本實驗練習(xí)測定根系活力的方法,為植物營養(yǎng)研究提供依據(jù)。一、原理氯化三苯基四氮唑(TTC)是標準氧化電位為80mV的氧化還原色素,溶于水中成為無色溶液,但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲腙,生成的三苯甲腙比較穩(wěn)定,不會被空氣中的氧自動氧化,所以TTC被廣泛地用作酶試驗的氫受體,植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原,可因加入琥珀酸,延胡索酸,蘋果酸得到增強,而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標。二、材料、設(shè)備儀器及試劑(一)材料:水培或砂培小麥、玉米等植物根系。(二)儀器設(shè)備:1.分光光度計;2.分析天平(感量);3.電子頂載天平(感量0.1g);4.溫箱;5.研缽;6.三角瓶50ml;7.漏斗;8.量筒100ml;9.吸量管10ml;10.刻度試管10ml;11.試管架;12.容量瓶10ml;13.藥勺;14.石英砂適量;15.燒杯10ml、1000ml。(三)試劑:1.乙酸乙酯(分析純)。2.次硫酸鈉(Na2S2O4),分析純,粉末°%TTC溶液準確稱取TTCl.Og,溶于少量水中。定容到100m1。用時稀釋至各需要的濃度。4.磷酸緩沖液(1/15mol/L,pH7)。5.lmol/L硫酸用量筒取比重的濃硫酸55m1,邊攪拌邊加入盛有500ml蒸餾水的燒杯中,冷卻后稀釋至1000ml。6.0.4mo1/L琥珀酸稱取琥珀酸4.72g,溶于水中,定容至100ml即成。三、實驗步驟(1)TTC標準曲線的制作?。TC溶液放入10ml量瓶中,加少許Na2S2O4粉搖勻后立即產(chǎn)生紅色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度,搖勻。然后分別取此液、、、、置10ml容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到含甲月替25聘、50卩g、100聘、150聘、200聘的標準比色系列,以空白作參比,在485nm波長下測定吸光度,繪制標準曲線。(2)稱取根尖樣品0.5g,放入10ml燒杯中,加入%TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10ml,把根充分浸沒在溶液內(nèi),在37°C下暗保溫1_3h,此后加入1mol/L硫酸2ml,以停止反應(yīng)。(與此同時做一空白實驗,先加硫酸,再加根樣品,其他操作同上)。(3)把根取出,吸干水分后與乙酸乙酯3—4ml和少量石英砂一起在研缽內(nèi)磨碎,以提出甲月替。紅色提取液移入試管,并用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌二、三次,皆移入試管,最后加乙酸乙酯使總量為10ml,用分光光度計在波長485nm下比色,以空白試驗作參比測出吸光度,查標準曲線,即可求出四氮唑還原量。四、結(jié)果計算四氮唑還原強度(mg/g(根鮮重)/h)=四氮唑還原量(mg)/[根重(g)x時間(h)]植物組織內(nèi)過氧化物酶(POD)活性的測定(實驗測試用)原理:過氧化物酶廣泛存在于植物的各個組織器官中。在有過氧化氫存在的條件下,過氧化物酶可以使愈創(chuàng)木酚氧化產(chǎn)生茶褐色物質(zhì),在470nm處有最大吸收峰,可根據(jù)單位時間內(nèi)A470的變化值,計算POD活性大小。儀器:電子天平;冰凍高速離心機;可見光分光光度計;電動玻璃勻漿劑等。試劑:20mMKH2PO4;100mMPBS:取0.2MNa2HPO4,與,混合?;旌暇鶆虮7磻?yīng)液:取100mMPBS50m1,加入愈創(chuàng)木酚28卩1,攪拌溶解,待溶液冷卻后加入30%的H2O219M混合均勻保存于冰箱中備用。方法:酶液制備:取1.0g植物葉片剪碎,置入玻璃勻漿杯中,加入預(yù)冷的20mMKH2PO45m1進行冰浴研磨提取。勻漿液低溫離心8500rpm15min,上清液為酶粗提液,定容到50ml供測定。酶活性測定:取光程為1cm的玻璃比色杯2只,一只加入反應(yīng)液3ml,20mMKH2PO41m1作為調(diào)零管。另一只加入反應(yīng)液3ml,提取的酶液1ml,立即開始計時,在470nm波長處進行比色,開始記錄數(shù)據(jù),然后每隔一分鐘記錄一次吸光度值,共測3min。3?計算:以每分鐘A470的化變值為一個相對酶活單位,計算植物組織內(nèi)過氧化物酶酶活力的大小\(單位:U/g鮮重))過氧化氫酶測定過氧化氫酶普遍存在于植物的所有組織中,其活性與植物的代謝強度及抗寒、抗病能力有一定關(guān)系,故常加以測定。一、原理:過氧化氫酶(catalase)屬于血紅蛋白酶,含有鐵,它能催化過氧化氫分解為水和分子氧,在此過程中起傳遞電子的作用,過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑??筛鶕?jù)h2o2的消耗量或02的生成量測定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量(反應(yīng)過量)的過氧化氫溶液,經(jīng)酶促反應(yīng)后,用標準高錳酸鉀溶液(在酸性條件下)滴定多余的過氧化氫。即可求出消耗的h2o2的量。二、材料、儀器設(shè)備及試劑一)材料:小麥葉片二)儀器設(shè)備:1.研缽;2.三角瓶;3.酸式滴定管;4.恒溫水浴;5.容量瓶。(三)試劑:1.10%H2SO4;2.0.2mol/L磷酸緩沖液;3.L高錳酸鉀標準液稱:取KMnO4(AR)3.1605g,用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml,再用L草酸溶液標定;4.LH2O2市售30%H2O2大約等于L,取30%H2O2溶液,稀釋至1000ml,用標準LKMnO4溶液(在酸性條件下)進行標定;5.L草酸:稱取優(yōu)級純2C12.607g,用蒸餾水溶解后,定容至1000ml。四、實驗步驟(一)酶液提取:取小麥葉片2.5g加入的磷酸緩沖溶液少量,研磨成勻漿,轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中,用該緩沖液沖洗研缽,并將沖洗液轉(zhuǎn)至容量瓶中,用同一緩沖液定容,4000rpm離心15min,上清液即為過氧化氫酶的粗提液。(二)取50ml三角瓶4個(兩個測定,另兩個為對照),測定瓶加入酶液,對照加煮死酶液,再加入LH2O2,同時計時,于30C恒溫水浴中保溫10min,立即加入10%。用LKMnO4標準溶液滴定,至出現(xiàn)粉紅色(在30min內(nèi)不消失)為終點。五、結(jié)果酶活性用每g鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的mg數(shù)表示:過氧化氫酶活性(H2O2mg/g/min)=(A-B)xVT/(WxVSxxt)式中:A對照KMnO4滴定ml數(shù);B酶反應(yīng)后KMnO4滴定ml數(shù);VT提取酶液總量(ml);VS反應(yīng)時所用酶液量(ml);W樣品鮮重(g);t反應(yīng)時間(min);KMnO4相當(dāng)于。超氧物歧化酶(SOD)活力一、原理超氧物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)普遍存在于動、植物體內(nèi),是一種清除超氧陰離子自由基的酶。本實驗依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍四唑(NBT)在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下,核黃素可被光還原,被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生02,可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙,后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除02,從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后,反應(yīng)液藍色愈深,說明酶活性愈低,反之酶活性愈高。據(jù)此可以計算出酶活性大小。二、材料、儀器設(shè)備及試劑(一)材料;水稻或小麥葉片(二)儀器設(shè)備:1.高速臺式離心機;2?分光光度計;3?微量進樣器;4?熒光燈(反應(yīng)試管處照度為4000Lx);5?試管或指形管數(shù)支。(三)試劑1.0.05mol/L磷酸緩沖液();2.130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:稱用磷酸緩沖液定容至100ml;ymol/L氮藍四唑溶液:稱取用磷酸緩沖液定容至100m1,避光保存;4.100卩mol/LEDTA-Na2溶液:稱取-Na2用磷酸緩沖液定容至1000ml;5.20卩mol/L核黃素溶液:稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml避光保存。三、實驗步驟酶液提取取一定部位的植物葉片(視需要定,去葉脈)0.5g于預(yù)冷的研缽中,1ml預(yù)冷的磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿,加緩沖液使終體積為5ml。取—2ml于1000rpm下離心20min,上清液即為SOD粗提液。顯色反應(yīng)取5ml指形管(要求透明度好)4支,2支為測定管,另2支為對照管,按下列加入各溶液:試劑(酶)用量(ml)終濃度(比色時)L磷酸緩沖液LMet溶液L750ymol/LNBT溶液gmol/L100gmol/LEDTA-Na2液卩mol/L20gmol/L核黃素卩mol/L酶液支對照管以緩沖液代替酶液蒸餾水總體積混勻后將1支對照管置暗處,其它各管于4000Lx日光下反應(yīng)20min(要求各管受光情況一致,溫度高時間縮短,低時延長)。SOD活性測定與計算至反應(yīng)結(jié)束后,以不照光的對照管做空白,分別測定其它各管的吸光度。四、結(jié)果計算已知SOD活性單位以抑制NBT

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