根系活力的測定

根系活力的測定（TTC法）植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長情況和活力水平直接影響地上部的生長和營養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水本。本實(shí)驗(yàn)練習(xí)測定根系活力的方法，為植物營養(yǎng)研究提供依據(jù)。一、原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是標(biāo)準(zhǔn)氧化電位為80mV的氧化還原色素，溶于水中成為無色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比較穩(wěn)定，不會被空氣中的氧自動氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗(yàn)的氫受體，植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，蘋果酸得到增強(qiáng)，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標(biāo)。二、材料、設(shè)備儀器及試劑（一）材料：水培或砂培小麥、玉米等植物根系。（二）儀器設(shè)備：1.分光光度計(jì)；2.分析天平（感量）；3.電子頂載天平（感量0.1g）；4.溫箱；5.研缽；6.三角瓶50ml；7.漏斗；8.量筒100ml；9.吸量管10ml；10.刻度試管10ml；11.試管架；12.容量瓶10ml；13.藥勺；14.石英砂適量；15.燒杯10ml、1000ml。（三）試劑：1.乙酸乙酯（分析純）。2.次硫酸鈉（Na2S2O4），分析純，粉末°%TTC溶液準(zhǔn)確稱取TTCl.Og，溶于少量水中。定容到100m1。用時稀釋至各需要的濃度。4.磷酸緩沖液（1/15mol/L，pH7）。5.lmol/L硫酸用量筒取比重的濃硫酸55m1，邊攪拌邊加入盛有500ml蒸餾水的燒杯中，冷卻后稀釋至1000ml。6.0.4mo1/L琥珀酸稱取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。三、實(shí)驗(yàn)步驟（1）TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作?。TC溶液放入10ml量瓶中，加少許Na2S2O4粉搖勻后立即產(chǎn)生紅色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度，搖勻。然后分別取此液、、、、置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月替25聘、50卩g、100聘、150聘、200聘的標(biāo)準(zhǔn)比色系列，以空白作參比，在485nm波長下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）稱取根尖樣品0.5g，放入10ml燒杯中，加入％TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10ml，把根充分浸沒在溶液內(nèi)，在37°C下暗保溫1_3h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反應(yīng)。（與此同時做一空白實(shí)驗(yàn)，先加硫酸，再加根樣品，其他操作同上）。（3）把根取出，吸干水分后與乙酸乙酯3—4ml和少量石英砂一起在研缽內(nèi)磨碎，以提出甲月替。紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯把殘?jiān)礈於⑷危砸迫朐嚬?，最后加乙酸乙酯使總量?0ml，用分光光度計(jì)在波長485nm下比色，以空白試驗(yàn)作參比測出吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出四氮唑還原量。四、結(jié)果計(jì)算四氮唑還原強(qiáng)度（mg/g（根鮮重）/h）=四氮唑還原量（mg）/［根重（g）x時間（h）］植物組織內(nèi)過氧化物酶（POD）活性的測定（實(shí)驗(yàn)測試用）原理：過氧化物酶廣泛存在于植物的各個組織器官中。在有過氧化氫存在的條件下，過氧化物酶可以使愈創(chuàng)木酚氧化產(chǎn)生茶褐色物質(zhì)，在470nm處有最大吸收峰，可根據(jù)單位時間內(nèi)A470的變化值，計(jì)算POD活性大小。儀器：電子天平；冰凍高速離心機(jī)；可見光分光光度計(jì)；電動玻璃勻漿劑等。試劑：20mMKH2PO4；100mMPBS:取0.2MNa2HPO4，與，混合?；旌暇鶆虮７磻?yīng)液：取100mMPBS50m1，加入愈創(chuàng)木酚28卩1，攪拌溶解，待溶液冷卻后加入30%的H2O219M混合均勻保存于冰箱中備用。方法：酶液制備：取1.0g植物葉片剪碎，置入玻璃勻漿杯中，加入預(yù)冷的20mMKH2PO45m1進(jìn)行冰浴研磨提取。勻漿液低溫離心8500rpm15min，上清液為酶粗提液，定容到50ml供測定。酶活性測定：取光程為1cm的玻璃比色杯2只，一只加入反應(yīng)液3ml，20mMKH2PO41m1作為調(diào)零管。另一只加入反應(yīng)液3ml，提取的酶液1ml，立即開始計(jì)時，在470nm波長處進(jìn)行比色，開始記錄數(shù)據(jù)，然后每隔一分鐘記錄一次吸光度值，共測3min。3?計(jì)算：以每分鐘A470的化變值為一個相對酶活單位,計(jì)算植物組織內(nèi)過氧化物酶酶活力的大小\（單位:U/g鮮重））過氧化氫酶測定過氧化氫酶普遍存在于植物的所有組織中，其活性與植物的代謝強(qiáng)度及抗寒、抗病能力有一定關(guān)系，故常加以測定。一、原理：過氧化氫酶（catalase）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑?？筛鶕?jù)h2o2的消耗量或02的生成量測定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過量）的過氧化氫溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的過氧化氫。即可求出消耗的h2o2的量。二、材料、儀器設(shè)備及試劑一）材料：小麥葉片二）儀器設(shè)備：1.研缽；2.三角瓶；3.酸式滴定管；4.恒溫水??；5.容量瓶。（三）試劑：1.10%H2SO4;2.0.2mol/L磷酸緩沖液；3.L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液稱：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml，再用L草酸溶液標(biāo)定；4.LH2O2市售30%H2O2大約等于L,取30%H2O2溶液，稀釋至1000ml,用標(biāo)準(zhǔn)LKMnO4溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定；5.L草酸：稱取優(yōu)級純2C12.607g，用蒸餾水溶解后，定容至1000ml。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）酶液提?。喝⌒←溔~片2.5g加入的磷酸緩沖溶液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液轉(zhuǎn)至容量瓶中，用同一緩沖液定容，4000rpm離心15min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。（二）取50ml三角瓶4個（兩個測定，另兩個為對照），測定瓶加入酶液，對照加煮死酶液，再加入LH2O2，同時計(jì)時，于30C恒溫水浴中保溫10min，立即加入10%。用LKMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至出現(xiàn)粉紅色（在30min內(nèi)不消失）為終點(diǎn)。五、結(jié)果酶活性用每g鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的mg數(shù)表示：過氧化氫酶活性（H2O2mg/g/min）=（A-B）xVT/（WxVSxxt）式中：A對照KMnO4滴定ml數(shù)；B酶反應(yīng)后KMnO4滴定ml數(shù);VT提取酶液總量（ml）;VS反應(yīng)時所用酶液量（ml）;W樣品鮮重（g）;t反應(yīng)時間（min）;KMnO4相當(dāng)于。超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）普遍存在于動、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生02，可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除02，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料；水稻或小麥葉片（二）儀器設(shè)備：1.高速臺式離心機(jī)；2?分光光度計(jì)；3?微量進(jìn)樣器；4?熒光燈（反應(yīng)試管處照度為4000Lx）;5?試管或指形管數(shù)支。（三）試劑1.0.05mol/L磷酸緩沖液（）；2.130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱用磷酸緩沖液定容至100ml;ymol/L氮藍(lán)四唑溶液：稱取用磷酸緩沖液定容至100m1，避光保存；4.100卩mol/LEDTA-Na2溶液：稱取-Na2用磷酸緩沖液定容至1000ml；5.20卩mol/L核黃素溶液：稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml避光保存。三、實(shí)驗(yàn)步驟酶液提取取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于預(yù)冷的研缽中，1ml預(yù)冷的磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使終體積為5ml。取—2ml于1000rpm下離心20min，上清液即為SOD粗提液。顯色反應(yīng)取5ml指形管（要求透明度好）4支,2支為測定管，另2支為對照管，按下列加入各溶液：試劑（酶）用量（ml）終濃度（比色時）L磷酸緩沖液LMet溶液L750ymol/LNBT溶液gmol/L100gmol/LEDTA-Na2液卩mol/L20gmol/L核黃素卩mol/L酶液支對照管以緩沖液代替酶液蒸餾水總體積混勻后將1支對照管置暗處，其它各管于4000Lx日光下反應(yīng)20min（要求各管受光情況一致，溫度高時間縮短，低時延長）。SOD活性測定與計(jì)算至反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對照管做空白，分別測定其它各管的吸光度。四、結(jié)果計(jì)算已知SOD活性單位以抑制NBT