氯沙坦對56腎切除大鼠腎組織gf-

氯沙坦對56腎切除大鼠腎組織gf-

腎衰竭和腎間質(zhì)纖維是腎衰竭的共同途徑和病理學基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)是促進腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化形成與發(fā)展的關(guān)鍵因子,TGF-β主要通過Smads信號通路誘導(dǎo)其下游因子表達而產(chǎn)生致纖維化效應(yīng),TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑(angiotensinⅡtype1receptorantagonists,AT1RA)通過阻斷血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)與其1型受體結(jié)合而起到重要的腎臟保護作用,在臨床上已得到廣泛的應(yīng)用。本實驗通過建立5/6腎切除誘導(dǎo)的大鼠腎小球硬化模型,觀察AT1RA類藥物氯沙坦對5/6腎切除大鼠殘余腎組織中TGF-β1,p-Smad2/3及Smad7表達的影響,探討AT1RA抗腎小球硬化的作用機制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1抗tgf-1多克隆抗體、p-smad2/3多克隆抗體的制備包括:氯沙坦片(商品名科素亞,杭州默沙東制藥公司),兔抗TGF-β1多克隆抗體、兔抗p-Smad2/3多克隆抗體及羊抗Smad7多克隆抗體(SantaCruz,USA),二抗試劑盒及DAB顯色劑(福州邁新生物試劑公司)。1.1.2實驗動物清潔級雄性Wistar大鼠由中南大學動物實驗學部提供,共25只,體質(zhì)量(200±20)g,生長良好,自由飲水進食,普食喂養(yǎng)。1.2方法1.2.1各組大鼠腎外切和各組全切時間及劑量實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分為假手術(shù)組(n=5)、5/6腎切除模型組(n=10)和氯沙坦治療組(n=10)。模型組和氯沙坦治療組大鼠均在無菌條件下行左腎2/3切除,1周后行右腎全切,而假手術(shù)組大鼠兩次手術(shù)均只分離腎臟。于第2次手術(shù)2周后開始,氯沙坦治療組以氯沙坦[20mg/(kg·d),溶于生理鹽水]灌胃,假手術(shù)組和模型組以等量生理鹽水灌胃。于第二次手術(shù)后12周(治療10周)處死所有大鼠。1.2.2觀察指標和方法1.2.2.1.尿蛋白、血液肌腱、尿素氮的測定處死前留取24h尿,用雙縮脲法檢測尿蛋白含量;處死時心臟取血,離心后取血清,用飽和苦味酸法檢測血肌酐、血尿素氮。1.2.2.腎組織膠原沉積術(shù)大鼠處死后留取腎組織,常規(guī)固定、包埋、切片,行HE染色觀察腎組織病理變化,Masson染色觀察腎組織膠原沉積,且每張Masson染色切片隨機選取10個包含腎小球的視野(×200)。借助HPIAS-1000圖像分析系統(tǒng),計算每例切片腎組織Masson染色陽性面積占整個視野百分比,將Masson染色所顯示的膠原相對面積作為腎組織膠原含量的評定指標。1.2.2.酶復(fù)染法(1)TGF-β1和p-Smad2/3:將3μm石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后經(jīng)3%過氧化氫室溫孵育20min,微波修復(fù)10min,加入一抗(TGF-β1稀釋濃度為1∶100,p-Smad2/3稀釋濃度為1∶400)4℃過夜,自然恢復(fù)至室溫,再依次加入抗原加強液37℃孵育20min及二抗37℃孵育30min(每步操作后均以PBS浸洗5min×3次);DAB顯色,蘇木素復(fù)染后,中性樹膠封片。(2)Smad7:將3μm石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后經(jīng)3%過氧化氫室溫孵育20min,0.2%胃酶37℃修復(fù)40min,血清封閉室溫30min,加入一抗(1∶100稀釋)4℃過夜,自然恢復(fù)至室溫,滴加生物素標記的第二抗體室溫孵育10min及鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液室溫孵育10min(除血清封閉外每步操作后均以PBS浸洗5min×3次);DAB顯色,蘇木素復(fù)染后,中性樹脂封片。以PBS替代一抗作為陰性對照。結(jié)果判定:(1)光鏡下觀察TGF-β1和Smad7胞漿棕黃色為陽性染色。參考文獻方法,在200倍光學顯微鏡下,每個標本隨機觀察15個視野,計算免疫組織化學陽性腎小管或間質(zhì)所占視野的百分比,進行半定量評分后取均值:無陽性染色,0分;<25%,1分;25～50%,2分;51%～75%,3分;>75%,4分。(2)光鏡下觀察p-Smad2/3胞核棕黃色為陽性染色。每例切片在高倍鏡(×400)下隨機選20個視野,計數(shù)每個視野陽性及總的細胞數(shù),折算成每200個總細胞數(shù)中的陽性細胞數(shù)用作分析。1.2.3數(shù)據(jù)分析及處理所有實驗數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件,組間比較采用單因素方差分析,認為P<0.05為有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1兩組患者的死亡情況因感染、腎功能衰竭等原因,至處死前模型組大鼠死亡5只,氯沙坦治療組死亡4只,假手術(shù)組無死亡。假手組外觀好,狀態(tài)正常,模型組大鼠活動遲緩,精神萎靡,毛發(fā)枯黃,體型消瘦,氯沙坦治療后明顯好轉(zhuǎn)。2.2組患者尿蛋白排泄量、血胱素氮水平變化情況比較模型組24h尿蛋白、血肌酐、尿素氮明顯較假手術(shù)組增高(P<0.01),氯沙坦治療組與模型組相比,尿蛋白排泄量明顯減少(P<0.01),血肌酐、尿素氮水平下降(P<0.05),但較假手術(shù)組高(P<0.01)(表1)。2.3各組大鼠腎組織病理學表現(xiàn)假手術(shù)組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)清晰,腎小球無肥大、硬化,腎小管無擴張,管腔內(nèi)無蛋白管型;模型組殘余腎組織可見腎小球肥大、玻璃樣變性,系膜區(qū)基質(zhì)增多,腎小囊變窄,腎小管擴張,可見較多蛋白管型,小管間質(zhì)炎癥細胞浸潤,間質(zhì)內(nèi)膠原沉積增多;氯沙坦組大鼠腎組織病變明顯減輕(圖1,圖2)。對Masson染色膠原含量進行半定量分析發(fā)現(xiàn),模型組膠原含量(0.379±0.030)較假手術(shù)組(0.146±0.029)明顯增高(P<0.01),以氯沙坦治療后,膠原沉積明顯減輕(0.218±0.019)(P<0.01)。2.4腎組織tgf-1、3表達變化假手術(shù)組大鼠腎組織TGF-β1呈弱陽性表達,模型組大鼠腎組織TGF-β1表達明顯增加,在腎小球硬化部位更明顯,顯著高于假手術(shù)組(P<0.01),經(jīng)氯沙坦治療后,TGF-β1表達明顯降低(P<0.05),僅呈弱陽性表達(圖3,表2)。假手術(shù)組大鼠腎組織p-Smad2/3呈弱陽性表達,模型組p-Smad2/3呈強陽性表達,經(jīng)氯沙坦治療,p-Smad2/3表達減弱(P<0.01)(圖4,表2)。假手術(shù)組腎組織Smad7表達較強,模型組腎組織Smad7表達明顯減弱(P<0.01),氯沙坦治療后Smad7表達較模型組增強(P<0.01)(圖5,表2)。3tgf-和smad7在足跖部腎組織中的表達腎素-血管緊張素系統(tǒng)在腎小球硬化進展中起非常重要的作用。AngⅡ是該系統(tǒng)的最重要的效應(yīng)分子,主要通過與1型受體結(jié)合而發(fā)揮其促腎小球硬化效應(yīng),AT1RA特異性地阻斷AngⅡ與其1型受體結(jié)合而起到抗腎小球硬化的作用。Fujihara等發(fā)現(xiàn)氯沙坦可以降低5/6腎切除大鼠血壓,減少尿蛋白,改善腎功能,延緩腎小球硬化進展,且其療效呈劑量依賴性。本實驗中,應(yīng)用氯沙坦20mg/(kg·d)治療5/6腎切除大鼠10周,結(jié)果顯示:24h尿蛋白、血肌酐、尿素氮以及腎組織病理改變均得到了不同程度的改善,與上述文獻報道一致。TGF-β是目前公認的導(dǎo)致細胞外基質(zhì)積聚的重要因子,AngⅡ可以誘導(dǎo)TGF-β表達從而促進腎小球硬化。Smads蛋白是TGF-β與其細胞膜上的受體結(jié)合后的胞內(nèi)激酶底物,介導(dǎo)了TGF-β的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。TGF-β通過Smads途徑誘導(dǎo)下游因子產(chǎn)生的基本過程如下:TGF-β在細胞膜上與TGF-βⅡ型受體結(jié)合后,使TGF-βI型受體磷酸化,其胞內(nèi)區(qū)絲氨酸/蘇氨酸激酶使胞漿中Smad2和Smad3的C-末端SSXS基序磷酸化,磷酸化的Smad2/3(p-Smad2/3)再與Smad4結(jié)合,形成Smad2,3,4復(fù)合物,隨后該復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)與TGF-β靶基因結(jié)合,啟動靶基因轉(zhuǎn)錄。在這個過程中,Smad2/3磷酸化為p-Smad2/3是關(guān)鍵的步驟,而Smad7作為抑制性Smad,與TGF-βI型受體結(jié)合,抑制Smad2/3的磷酸化,起負反饋調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn),TGF-β/Smads信號通路在腎小球硬化發(fā)病機制中起重要作用。Taal等發(fā)現(xiàn)5/6腎切除大鼠腎組織中TGF-β1的表達持續(xù)增加,并伴有進行性的腎小球硬化和間質(zhì)纖維化,與本實驗結(jié)果一致。Noda等證實,AT1RA類藥物坎地沙坦可以抑制5/6腎切除大鼠腎組織TGF-β1的表達,減輕其腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化病變,本實驗發(fā)現(xiàn)應(yīng)用另一種AT1RA類藥物氯沙坦同樣可以減少5/6腎切除大鼠腎組織TGF-β1的表達。Hou等在5/6腎切除模型中,利用超聲微泡技術(shù)誘導(dǎo)Smad7的表達,結(jié)果顯示,Smad2/3激活被抑制,同時伴有尿蛋白、血肌酐明顯減少,腎組織纖維化病變得到明顯改善。在本實驗中,5/6腎切除后腎組織p-Smad2/3表達增強,Smad7表達