益腎活血方對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織gf-

益腎活血方對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織gf-

糖尿病性腎衰（dn）是腎衰竭最常見的原因。近年研究發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)化因子-β1(transforminggrowthfactor,TGF-β1)與p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,p38MAPK)通路之間形成正負(fù)反饋機(jī)制,共同加速了DN的發(fā)生發(fā)展。本研究旨在觀察益腎活血方對(duì)DN大鼠腎組織內(nèi)TGF-β1/p38MAPK表達(dá)的影響,以期探討中藥復(fù)方治療DN的療效機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。1免疫法益腎活血方(黃芪、生地黃、菟絲子、積雪草、大黃、水蛭等組成)在河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院加工成濃縮藥液;鏈脲佐菌素(STZ,美國(guó)Sigma公司);兔抗大鼠TGF-β1、p-p38MAPK一抗、生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG、聯(lián)苯二胺(DAB)顯色劑(中杉金橋生物有限公司);血糖分析儀及試紙(美國(guó)強(qiáng)生公司);PB4002-S電子天平(瑞士梅特勒—托利多儀器有限公司);RM2245輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司);EG1150N組織自動(dòng)包埋機(jī)(德國(guó)Leica公司);TK-218V恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)(湖北泰維醫(yī)療科技公司);C-3020ZOOM光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);DM5500免疫熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。1.2動(dòng)物、群體和模型1.3腎組織tgf-1、p-3gmak表達(dá)面積的檢測(cè)大鼠造模成功后灌胃第6周末,禁食不禁水,代謝籠留取24h尿液,并于第2天麻醉后,股動(dòng)脈取血2mL,采用AU800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血糖(GLU)水平和24h尿蛋白定量。處死大鼠,切取左側(cè)腎臟,去除被膜,迅速稱質(zhì)量;取右腎少量組織,常規(guī)制片,過碘酸雪夫反應(yīng)(PAS)染色,光鏡下放大400倍觀察腎組織病理變化;測(cè)量腎小球直徑、腎小管短徑距離判斷腎小球肥大程度和腎小管的腫脹程度,具體測(cè)量方法:光鏡下,淺層皮質(zhì)區(qū)隨機(jī)取10個(gè)腎小球,用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量腎小球直徑,取平均值;避開腎小球和細(xì)小動(dòng)脈隨機(jī)取10個(gè)腎小管視野,計(jì)算完整腎小管數(shù)目,用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量每個(gè)完整腎小管的近曲小管短徑距離,取平均值;采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)(操作按試劑盒說明進(jìn)行)腎組織TGF-β1、p-p38MAPK的表達(dá)面積。采用SPSSVersion13.0forWindows進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA),統(tǒng)計(jì)顯著性水平P<0.05。2結(jié)果2.1大鼠的體質(zhì)量變化正常組大鼠體質(zhì)量正常增加,飲食正常,眼睛有神,反應(yīng)敏捷,活動(dòng)自如,皮毛柔順有光澤,肌肉豐滿,尿量正常;其他2組大鼠造模成功后,均出現(xiàn)明顯的多飲、多尿、多食,并逐漸出現(xiàn)精神萎靡,皮毛粗糙,反應(yīng)遲鈍,少動(dòng)抱團(tuán)等氣陰兩虛癥狀。中藥灌胃后,大鼠精神轉(zhuǎn)好,皮毛仍略粗糙,活動(dòng)趨向正常,體質(zhì)量下降。至實(shí)驗(yàn)第6周,正常組體質(zhì)量正常,約(309.7±5.4)g;模型組體質(zhì)量(356.8±7.6)g;治療組體質(zhì)量(346.6±9.7)g,提示益腎活血方能改善DN臨床癥狀,對(duì)各組大鼠體質(zhì)量有一定影響,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2治療組和模型組比較灌胃6周后,24h尿蛋白定量,血清Scr、BUN及血糖水平模型組與正常組比較均顯著增高(P<0.01),治療組與模型組比較顯著下降(P<0.01);而ALB水平模型組顯著低于正常組(P<0.05),治療組顯著高于模型組(P<0.05)。2.3治療組和正常組腎組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)圖1(見彩圖頁第749頁)、表2結(jié)果顯示:正常組腎小球結(jié)構(gòu)及體積正常;模型組腎小球彌漫性球性肥大,系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕度增生,腎小球基底膜(GBM)彌漫增厚、僵直,節(jié)段擴(kuò)張,腎小管短徑距離增寬,完整腎小管數(shù)目減少,與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);治療組腎小球略顯肥大,毛細(xì)血管袢擴(kuò)張、偶見系膜節(jié)段輕度增生,腎小管短徑距離變窄,腫脹減輕,完整腎小管數(shù)目增多,與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)各組大鼠腎質(zhì)量、肥大指數(shù)(腎質(zhì)量/體質(zhì)量)進(jìn)行測(cè)量的結(jié)果顯示:與正常組比較,模型組腎質(zhì)量和肥大指數(shù)均顯著升高(P<0.01);治療組與模型組比較,腎質(zhì)量和肥大指數(shù)均顯著降低(P<0.01)。2.4各組腎組織免疫組織化學(xué)結(jié)果2.4.1節(jié)段系膜、毛細(xì)管壁、足細(xì)胞、壁層上皮細(xì)胞表達(dá)陽性模型組圖2(見彩圖頁第749頁)結(jié)果顯示:正常組小球節(jié)段系膜和毛細(xì)血管壁陽性;模型組小球節(jié)段系膜、毛細(xì)血管壁、足細(xì)胞、壁層上皮細(xì)胞陽性,部分小管上皮細(xì)胞陽性;治療組小球節(jié)段系膜和毛細(xì)血管壁陽性,偶見小管上皮細(xì)胞胞漿弱陽性。2.4.2腎組織tgf-1和p-3gp-mapk表達(dá)比較圖3(見彩圖頁第749頁)結(jié)果顯示:正常組偶見小管上皮細(xì)胞胞漿弱陽性;模型組部分小管上皮細(xì)胞胞漿陽性;治療組偶見少數(shù)小管上皮細(xì)胞胞漿弱陽性。表3、圖2、圖3結(jié)果顯示:在DN大鼠腎組織中,TGF-β1在腎小球和腎小管均有表達(dá),而p-p38MAPK僅在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá),與正常組比較,模型組TGF-β1、p-p38MAPK表達(dá)顯著增加(P<0.01);與模型組比較,治療組2指標(biāo)表達(dá)均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。3開展腎組織病機(jī)的認(rèn)識(shí)及模型檢測(cè)DN病理特征為腎小球系膜區(qū)增寬、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)積聚、基底膜(GBM)增厚及腎小球硬化。研究發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)化因子-β(transforminggrowthfactor,TGF-β1)可明顯增加ECM成分如膠原Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ及纖粘連蛋白的表達(dá),是目前已知致硬化作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子。TGF-β1具有廣泛的生物學(xué)作用,可誘導(dǎo)局部血管增生、ECM生成,在DN的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。TGF-β1促進(jìn)ECM合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑較多,其中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)途徑是近年來倍受關(guān)注的一種,它在高血糖條件下被激活,可將胞外刺激信號(hào)傳遞給胞核,是細(xì)胞再生和損傷應(yīng)激的信號(hào)通路,在一定程度上可加速DN的發(fā)展。p38MAPK作為MAPK的重要成員之一,在各種細(xì)胞外刺激下,可被磷酸化為p-p38MAPK而激活,細(xì)胞漿中的p38MAPK即移位到細(xì)胞核,導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡,進(jìn)而調(diào)節(jié)TGF-β1等許多細(xì)胞因子的表達(dá),因此,p38MAPK是細(xì)胞信號(hào)傳遞的交匯點(diǎn)或共同通路。p38MAPK的磷酸化水平,在人類DN的腎小球和小管間質(zhì)的損傷的過程中發(fā)揮一定作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí):高糖可以使系膜細(xì)胞(Msc)和腎小管上皮細(xì)胞,通過激活p38MAPK通路使TGF-β1的合成增多,并增加體外培養(yǎng)的Msc的TGF-β1基因增強(qiáng)子的活性;TGF-β1不僅增強(qiáng)p38MAPK的活性而發(fā)揮其生物活性,相反p38MAPK又可通過影響TGF-β1的生成而影響著DN的進(jìn)程。本病的中醫(yī)病機(jī)由消渴陰虛燥熱演變而來,陰虛為本,燥熱為標(biāo),陰津愈損,燥熱愈盛,灼熱傷津,兩者互為因果,久則津傷氣耗形成氣陰兩虛證。瘀血阻絡(luò)為DN的基本病機(jī),濕邪困阻中焦為促使DN進(jìn)展的重要因素。因此,DN早期的基本病機(jī)為氣陰兩虛兼濕濁血瘀。上述病機(jī)特點(diǎn),已被大量臨床觀察所證實(shí)。本研究依據(jù)中醫(yī)“久病必瘀”、“久病必虛”的理論,認(rèn)為DN基本病機(jī)多屬氣陰虧虛、濕瘀內(nèi)停。采用益氣養(yǎng)陰、活血利濕治法,自擬益腎活血方,藥用生黃芪、生地黃、菟絲子、積雪草、大黃、水蛭等,功能益氣養(yǎng)陰、活血利濕。臨床觀察表明該方可以顯著降低DN患者蛋白尿、血清尿素氮、肌酐水平,改善腎功能,延緩腎功能損害進(jìn)程。本研究結(jié)果提示:模型組腎組織內(nèi)TGF-β1、p-p38MAPK的表達(dá),24h尿蛋白量,Scr、BUN、血糖水平,腎小球體積,腎質(zhì)量及肥大指數(shù),腎小球直徑及腎小管短徑均顯著增加,而完整腎小管數(shù)量、血清ALB水平顯著減少,與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),結(jié)合腎組織病理及血糖水平變化,提示DN模型復(fù)制成功。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示:治療組可以減少DN大鼠腎組織TGF-β1、p-p38MAPK的表達(dá),且與減少蛋白尿,降低血清肌酐、尿素氮、血糖水平,及升高ALB水平,縮小腎小球直徑及腎小管短徑,減少腎質(zhì)量及肥大指數(shù),增加腎小管的完整數(shù)目,減輕腎組織病理損害等作用呈正相關(guān)。研究結(jié)果還顯示TGF-β1在腎小球及腎小管均有表達(dá),而p-p38MAPK僅在小管上皮細(xì)胞胞漿表達(dá),提示益腎活血方可能通過影響TGF-β1/p-p38MAPK的表達(dá),而發(fā)揮保護(hù)DN腎小球及腎小管功能、最終防止腎間質(zhì)纖維化的作用。1.1實(shí)驗(yàn)分組及給藥清潔級(jí)成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,體質(zhì)量(230±20)g,8周齡,購(gòu)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):907048。飼養(yǎng)于河南中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后隨機(jī)分為3組,即正常組、模型組及治療組,各10只。正常組予以普通飼料喂養(yǎng),模型組與治療組予以高糖高脂飲食(質(zhì)量分?jǐn)?shù):60%普通飼料、10%豬油、5%膽固醇、10%蛋黃粉和10%蔗糖構(gòu)成)的同時(shí),用1mg/LSTZ按55mg/kg的劑量一次性腹腔注射,復(fù)制DN模型