第4章-藥物定量分析

第四章

藥物定量分析與

分析方法驗證第一節(jié)

含金屬或鹵素有機藥物

的前處理方法

一．有機藥物中金屬或鹵素的結(jié)合狀態(tài)二．不經(jīng)有機破壞的分析方法三．經(jīng)有機破壞的分析方法1．含金屬的有機藥物金屬原子不直接與碳原子相連

----結(jié)合不牢固有機酸及酚的金屬鹽或配位化合物。金屬原子直接與碳原子以共價鍵相連

----結(jié)合牢固

有機金屬藥物一．有機藥物中金屬或鹵素的結(jié)合狀態(tài)2．含鹵素的有機藥物鹵素和芳環(huán)相連：

結(jié)合牢固鹵素和脂肪鏈的碳原子相連：

結(jié)合不牢固（一）直接測定法適用于：水溶液中可以電離的藥物二．不經(jīng)有機破壞的分析方法金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬藥物某些C-M鍵結(jié)合不牢固的有機金屬藥物如富馬酸亞鐵的含測直接回流后測定法：

適用于鹵素原子結(jié)合不牢固的含鹵素有機藥物

三氯叔丁醇的含測/六氯對二甲苯硫酸水解后測定法：

適用于金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬的有機藥物。

硬脂酸鎂的含測（二）經(jīng)水解后測定法1．堿性還原后測定適用于鹵素原子和芳環(huán)結(jié)合的含鹵素有機藥物。生成的無機鹵化物用銀量法測定.2．酸性還原后測定同上3．利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量含Sb5+藥物，含F(xiàn)e3+藥物（三）經(jīng)氧化還原后測定法

適用于結(jié)合狀態(tài)牢固的有機金屬藥物和含鹵素有機藥物（一）濕法破壞利用強氧化劑將有機金屬轉(zhuǎn)變成金屬離子。1．硝酸-高氯酸法適用于血、尿、組織等生物樣品的破壞。破壞后的金屬離子以高價態(tài)存在。對含氮雜環(huán)藥物的破壞不夠完全。三．經(jīng)有機破壞的分析方法2．硝酸-硫酸法適用于大多數(shù)有機藥物的破壞，但不適用于含堿土金屬有機藥物的破壞。（生成硫酸鹽沉淀）破壞后的金屬離子以高價態(tài)存在。３．硫酸-硫酸鹽法常用于含砷或銻有機藥物的破壞，得到低價態(tài)的三價砷或銻離子。（二）干法破壞

----將有機物灼燒灰化適用于濕法不易破壞完全的有機藥物及某些不能用硫酸破壞的有機藥物不適用于含易揮發(fā)金屬有機藥物的破壞（砷、汞）常加入無水碳酸鈉或輕質(zhì)氧化鎂助灰化

-----是一種能將有機化合物中的待測元素定量分解成離子的快速有機破壞方法應(yīng)注意的有關(guān)問題：氧氣要充足，確保燃燒完全燃燒產(chǎn)生的煙霧應(yīng)被完全定量吸收（三）氧瓶燃燒法

oxygenflaskcombustionmethod樣品點燃放入燃燒瓶后，應(yīng)用手按緊瓶塞（最好用少量水封閉瓶口），直到火焰熄滅，以防燃燒產(chǎn)生的熱氣將瓶塞頂動；測定氟化物，應(yīng)用石英燃燒瓶。生成的HF腐蝕玻璃，且與玻璃中的硼生成BF3(BF3在水溶液中僅部分解離成氟離子，使氟的測定結(jié)果偏低)；燃燒瓶洗凈；防爆。第二節(jié)

定量分析方法特點一．容量分析法二．光譜分析法三．色譜分析法一．容量分析法1．方法：2．關(guān)鍵：

準(zhǔn)確地確定等當(dāng)點3．滴定誤差：滴定終點與等當(dāng)點之間的誤差

將已知濃度的滴定液由滴定管加到待測藥物的溶液中，直到所加滴定液與被測藥物按化學(xué)計量反應(yīng)完全為止，然后根據(jù)滴定液的濃度和消耗的體積，就可以計算出被測藥物的含量滴定液與被測藥物完全作用，反應(yīng)達(dá)到化學(xué)計量點即等當(dāng)點4．特點：簡便，快速，精密、準(zhǔn)確專屬性、靈敏度較差

常用于測定高含量或中含量組分

1%以上的含量5．計算問題滴定度T：指每ml某摩爾濃度的滴定液所相當(dāng)?shù)谋粶y藥物的重量

aA+bB?cC+dDT=M×(b/a)×B（mg/ml）

M:滴定液的毫摩爾濃度(mmol/ml)；

B:被測藥物的毫摩爾質(zhì)量(mg/mmol)百分含量計算：直接滴定：含量%=F=滴定液的實際摩爾濃度/滴定液的規(guī)定摩爾濃度剩余滴定（做空白實驗）：先加入定量過量的滴定液A,當(dāng)與被測藥物反應(yīng)完全后,再用另一滴定液B回滴剩余的滴定液A

含量%=

V0：空白試驗消耗滴定液B的體積

VB：樣品測定試驗消耗滴定液B的體積二．光譜分析法1．Lambert-Beer定律ε：摩爾吸收系數(shù)：百分吸收系數(shù)

ε=×(M/10)（一）UV-Vis分光光度法2．儀器校正和檢定波長校正：儀器使用前校正吸收度準(zhǔn)確度的檢定：用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定雜散光的檢查：3.對溶劑的要求溶劑在所選波長附近的吸收度應(yīng)不超過一定值空氣為空白4．測定法核對:

供試品的實際吸收峰波長是否與藥典給出的波長一致(±1nm)

如果不一致，可能與試樣的真?zhèn)巍⒓兌燃皟x器波長的準(zhǔn)確度有關(guān).選擇合適的定量方法測定校正曲線法對照法吸收系數(shù)法:

儀器應(yīng)仔細(xì)校對、檢定計算分光光度法以配制供試品溶液的同批溶劑為空白1．特點應(yīng)在低濃度溶液中進行

高濃度：產(chǎn)生內(nèi)濾光效應(yīng)和自吸收現(xiàn)象線性偏離內(nèi)濾光效應(yīng)：溶液中存在能吸收激發(fā)光和熒光的物質(zhì)，使熒光強度減少。干擾多，需做空白試驗（二）熒光分析法校正儀器靈敏度：供試品對激發(fā)光穩(wěn)定：可用樣品的對照品溶液校正供試品對激發(fā)光不穩(wěn)定：

采用發(fā)射光譜與供試品近似的物質(zhì)校正

藍(lán)色熒光---硫酸奎寧的稀硫酸溶液黃綠色熒光---熒光素鈉水溶液紅色熒光---羅丹明B水溶液2．含量測定

Cx=×Cs

0.5-2.0

熒光強度與藥物濃度成正比關(guān)系1．HPLC法最常用固定相：

octadecylsilane-bondedsilicagel

十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS或C18）柱溫、檢測器：

室溫、紫外檢測器三.色譜分析法藥典正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分和檢測器類型不得任意改變外，其余條件如色譜柱內(nèi)經(jīng)、長度、固定相牌號、流動相流速及各組分比例等可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體樣品品種及達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗的要求。

系統(tǒng)適用性試驗色譜柱的理論塔板數(shù)分離度重復(fù)性拖尾因子色譜柱的理論塔板數(shù)N=5.54(tR/W1/2)2=16(t/W)2

改變柱長、內(nèi)徑、固定相牌號、固定相顆粒粒徑等

定量峰與其它峰或內(nèi)標(biāo)峰之間的分離度R應(yīng)大于1.5分離度取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進樣5次，其峰面積測量值的RSD不應(yīng)大于2.0%配制相當(dāng)于80%，100%，120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進樣3次，計算平均校正因子，其RSD不應(yīng)大于2.0%重復(fù)性

T=W0.05h/2AW0.05h：0.05峰高處的峰寬

A：峰前沿與色譜峰頂點至基線的垂線之間的距離峰高法定量：T應(yīng)在0.95-1.05之間拖尾因子藥物分析中常用的HPLC定量方法：內(nèi)標(biāo)法：

內(nèi)標(biāo)校正曲線法內(nèi)標(biāo)一點法：對照法內(nèi)標(biāo)校正因子法外標(biāo)法：

標(biāo)準(zhǔn)曲線法外標(biāo)一點法：對照法2．氣相色譜法藥典正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定液品種、檢測器類型及特殊指定的色譜柱材料不得任意改變外，其余條件如色譜柱內(nèi)經(jīng)、長度、載體牌號、載氣流速等可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體品種及系統(tǒng)適用性試驗的要求。系統(tǒng)適用性試驗：同HPLC定量方法：手動進樣：內(nèi)標(biāo)法消除較大的進樣誤差留針時間、氣化室高溫自動進樣：內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法頂空進樣：標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法(內(nèi)加法)

消除基質(zhì)效應(yīng)的影響供試品和對照品處于不完全相同的基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法精密稱取待測成分對照品適量，配制成適當(dāng)濃度的對照品溶液，取一定量，精密加入到供試品溶液中，根據(jù)外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法測定主成分含量，再扣除加入的對照品溶液含量，即得供試品溶液中主成分含量。外標(biāo)法按下述公式進行計算：加入對照品溶液前、后校正因子應(yīng)相同，即：Cx和Ax：供試品中組分X的濃度和色譜峰面積；△Cx：所加入的已知濃度的待測組分對照品的濃度；Ais：加入對照品后組分X的色譜峰面積。第三節(jié)

藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法

驗證

需驗證的分析項目：鑒別試驗雜質(zhì)限度或定量檢查原料藥或制劑中有效成分的含量測定制劑中其它成分的含量測定溶出度、釋放度測定方法

需驗證的內(nèi)容：準(zhǔn)確度精密度專屬性檢測限定量限線性線性范圍耐用性一．準(zhǔn)確度高、中、低三個濃度，每個濃度3份1．原料藥：

用已知純度的對照品測定。2．制劑：用含已知量被測物（對照品）的各組分混合物進行測定－－回收率若不能得到制劑的全部組分，可向已測定含量的制劑中加入已知量待測物（對照品）進行測定。

－－加樣回收率1．表示方法

標(biāo)準(zhǔn)偏差SD

相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

relativestandarddeviationRSD

即變異系數(shù)

coefficientofvariationCV二．精密度2.重復(fù)性在相同條件下，由同一個分析人員測定同一種樣品所得結(jié)果的精密度。

日內(nèi)精密度測定高、中、低3個不同濃度的樣品，每個濃度測定3-5份樣本?；蛞环N濃度的溶液連續(xù)測定6次。3．中間精密度在同一個實驗室、不同時間由不同分析人員用不同儀器測定結(jié)果的精密度。常做日間精密度

由于測定持續(xù)時間長，往往在同一天內(nèi)不能完成，故樣品測定時使用的儀器性能、試劑、標(biāo)準(zhǔn)曲線及環(huán)境條件等都可能發(fā)生變化，而使測定結(jié)果發(fā)生變化。４．重現(xiàn)性在不同實驗室，由不同分析人員測定結(jié)果的精密度。若分析方法作為法定標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)做指樣品中有其他成分存在時，分析方法能準(zhǔn)確測定出待測藥物的特性鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測定：均考察專屬性對鑒別反應(yīng)：不含被測藥物的樣品，應(yīng)呈負(fù)反應(yīng)三．專屬性對雜質(zhì)檢查和含量測定：待測成分應(yīng)能與其它成分分離給出代表性圖譜，說明專屬性若無雜質(zhì)和降解產(chǎn)物，可用強光照射、高溫、高濕、酸破壞、堿破壞、氧化破壞的方法，產(chǎn)生雜質(zhì)和降解產(chǎn)物．指待測物能被檢測出的最低濃度或量。反映：分析方法與儀器的靈敏度、儀器的噪音大小、

樣品經(jīng)處理后空白值的高低。

四．檢測限

limitofdetection,LOD１．UV-Vis和熒光分光光度法做多次空白試驗，求背景響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，則:LOD=3SD有時用校正系數(shù)進行校正：UV-Vis：

LOD=f×3SD=（C樣

/A樣）×3SD熒光分析：

LOD=f×3SD=[C樣

/（F樣-F空）]×3SD2．色譜法

S/N=2或3時的對應(yīng)濃度或注入儀器的量指待測物能被定量測定的最低濃度或量。能滿足一定準(zhǔn)確度和精密度的要求S/N=10時，待測物濃度或注入儀器的量五．定量限limitofquantitation,LOQ在一定濃度范圍內(nèi)，測試結(jié)果與樣品中待測物濃度或量直接呈正比關(guān)系的程度。UV法：C~A色譜法：C~HorA數(shù)據(jù)要求：回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性圖。至少5個點六．線性達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性，測試方法適用的高、低限濃度或量的區(qū)間。通常指線性范圍七．范圍

當(dāng)測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度。常見變動因素：被測溶液的穩(wěn)定性；樣品提取次數(shù)、時間等；HPLC中：流動相組成和pH，色譜柱的廠牌、批號，柱溫，流動相流速等；GC中：色譜柱的廠牌、批號，固定相和載體的類型，柱溫等。八．耐用性

驗證分析方法的具體內(nèi)容

鑒別雜質(zhì)檢查含量測定及溶出度測定定量限度準(zhǔn)確度－＋－＋重復(fù)性精密度中間精密度－－＋＋*－－＋＋*專屬性＋＋＋＋檢測限－－**＋－定量限－＋－－線性－＋－＋范圍－＋－＋耐用性＋＋＋＋*已有重現(xiàn)性驗證，則不需**視具體情況予以驗證第四節(jié)

生物樣品分析概述

一．常用樣品的種類、采集和貯藏二．生物樣品分析預(yù)處理技術(shù)三．定量分析方法驗證常用品種：血液、尿液、唾液其次：可用乳汁、淚液、腦脊液、膽汁等。（一）生物樣品一．常用樣品的種類、采集和貯藏

1．血樣

血細(xì)胞血漿（plasma）血小板血清（serum）血細(xì)胞測定血樣中平均分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的藥濃抗凝自然全血（加抗凝劑）血液采樣與保存采樣：保存：血樣（血漿、血清）及時分離→冷藏或-70℃，有時加入穩(wěn)定劑

穩(wěn)定劑：酶抑制劑（NaF、三氯醋酸），抗氧劑解凍方法：

2．尿樣目的：藥物劑量回收，藥物清除率，藥物代謝和生物利用度特點：濃度高，易于收集，體內(nèi)代謝研究，應(yīng)作水解處理保存：立即測定（尿中含水、無機鹽、尿素等）；4℃保存；放置較長時間需冷凍；加入防腐劑（1%甲苯；飽和氯仿）或改變pH1、預(yù)處理的目的存在形式的多樣性：游離、結(jié)合物、代謝物濃度低，雜質(zhì)多出現(xiàn)渾濁和沉淀影響色譜柱壽命二．生物樣品分析預(yù)處理技術(shù)藥物理化性質(zhì)：

pKa

親脂性揮發(fā)性溶解度穩(wěn)定性光譜特征與蛋白的結(jié)合程度濃度范圍：

測定目的：定性定量母體代謝生物樣品的種類：樣品處理與分析方法的選擇

①專一性②靈敏性2、預(yù)處理方法選擇的一般原則3、生物樣品中蛋白質(zhì)的處理（1）目的：去除蛋白質(zhì)，使結(jié)合型藥物和代謝物釋放出來，