基因表達(dá)與功能基因?qū)W

基因表達(dá)與功能基因?qū)W

自1995年出版以來，已經(jīng)完成了42種微生物遺傳因素的篩選，包括桿菌和腸球菌。這些全基因組序列的測(cè)定為進(jìn)一步研究各種微生物的基因功能奠定了基礎(chǔ)。研究基因功能的重要方法之一是構(gòu)建基因的突變體來檢測(cè)其表型的變化,以推測(cè)某個(gè)基因在生長(zhǎng)過程中起到怎樣的作用。最直接的方法是將目的基因敲除,這樣可以保證被研究的基因完全失活。微生物基因敲除的傳統(tǒng)方法是利用微生物本身的RecA重組系統(tǒng)。RecA重組系統(tǒng)是大腸桿菌內(nèi)源性的同源重組機(jī)構(gòu),它由RecA和RecBCD組成。RecA蛋白促進(jìn)各類DNA分子間的同源聯(lián)會(huì)、配對(duì)以及鏈交換和分支遷移。RecBCD分子量較大、是一個(gè)由RecB,RecC和RecD組成的復(fù)合體,功能多樣,是ATP依賴的外切酶V和解旋酶,它與雙鏈切口結(jié)合,解開DNA并在Chi位點(diǎn)產(chǎn)生單鏈DNA,繼而由RecA蛋白促進(jìn)同源重組。由于RecBCD具有核酸外切酶V的活性,所以線性DNA分子在細(xì)菌體內(nèi)會(huì)被降解,必須要以環(huán)形的質(zhì)粒狀態(tài)存在才能不被分解。而且必須將靶基因兩側(cè)至少200bp的DNA序列克隆至自殺質(zhì)粒上,并在其中間插入抗藥性基因。通過結(jié)合轉(zhuǎn)移,依靠RecA同源重組系統(tǒng)將自殺質(zhì)粒整合于細(xì)菌的染色體上。整合于染色體上的自殺質(zhì)粒又可以發(fā)生第二次同源重組,重組的結(jié)果會(huì)有兩種可能:一是把目的基因敲除,通過抗藥性基因的篩選,就可以篩選到二次重組子(即基因敲除的缺失突變體);另一種情況是回復(fù)為原始的分子狀態(tài)。利用RecA重組進(jìn)行的基因敲除為研究微生物基因的功能奠定了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。應(yīng)用較廣的主要有定點(diǎn)突變、變性雙鏈法實(shí)現(xiàn)基因敲除等技術(shù)。但是以RecA重組為基礎(chǔ)的基因敲除具有較大的不足之處。首先是需要較長(zhǎng)的靶基因同源臂,且必須構(gòu)建具有靶位點(diǎn)的打靶質(zhì)粒。另外是RecA重組發(fā)生幾率很低,很難獲得所需要的重組子。近來由Murphy和Stewart等人用噬菌體λ的Red重組系統(tǒng)在大腸桿菌中建立的快速敲除原核基因的方法簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作,使實(shí)驗(yàn)周期大大縮短。下面對(duì)Red重組系統(tǒng)的組成、重組機(jī)理及在微生物基因敲除中的應(yīng)用做一綜述。1蛋白及gam基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)Red重組系統(tǒng)屬于λ噬菌體的重組系統(tǒng),其編碼基因exo、bet和gam置于PL操縱子的控制之下。exo基因的產(chǎn)物是λ核酸外切酶,它可將dsDNA5′端切開,產(chǎn)生3′端突出。由結(jié)晶學(xué)研究發(fā)現(xiàn),該核酸外切酶在溶液中是環(huán)形三聚體,具有一個(gè)到達(dá)中心的通道,一端可以調(diào)節(jié)dsDNA,另一端調(diào)節(jié)ssDNA。bet基因編碼的β蛋白,可與ssDNA結(jié)合促進(jìn)互補(bǔ)鏈的復(fù)性,并可以介導(dǎo)DNA鏈退火和交換反應(yīng)。它在溶液中的游離狀態(tài)為環(huán)狀物,當(dāng)結(jié)合到ssDNA時(shí)形成大的環(huán)狀物,當(dāng)結(jié)合到dsDNA時(shí)形成螺旋狀纖維。這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)揭示了β蛋白屬于重組蛋白家族中的一員,該家族包括Salmonella噬菌體P22的Erf蛋白,E.coli隱蔽型原噬菌體Rac的RecT蛋白,真核生物的Rad52蛋白。β蛋白與λ核酸外切酶形成復(fù)合物,調(diào)節(jié)核酸溶解(nucleolytic)和重組啟動(dòng)。gam基因的產(chǎn)物是一個(gè)分子量為16000Da的多肽,結(jié)合到宿主的RecBCD蛋白,形成二聚體,抑制RecBCD的外切酶活性。另外E.coli隱蔽型原嗜菌體Rac的重組系統(tǒng)與Red重組系統(tǒng)相似。前者的recE與exo相似,編碼一種核酸外切酶;recT與bet相似,編碼一種結(jié)合于ssDNA促使鏈交換的蛋白。二者的重組機(jī)理相同,可以說是同一類重組系統(tǒng)。2同源重組ssd-pcr檢測(cè)有關(guān)λ噬菌體重組系統(tǒng)方面的研究已有數(shù)十年的歷史,自上世紀(jì)60年代始,就有人報(bào)導(dǎo)λ編碼的產(chǎn)物可以促進(jìn)細(xì)菌發(fā)生重組,Clark和他的同事發(fā)現(xiàn)具有λRed系統(tǒng)的菌株在同源重組時(shí)不依賴細(xì)菌本身的重組系統(tǒng)。因而認(rèn)為Red重組是一個(gè)獨(dú)立的重組系統(tǒng)。其重組的分子機(jī)制如下:同源重組涉及到參與重組的兩條dsDNA的斷裂和復(fù)合。在Red重組系統(tǒng)中,該系統(tǒng)表達(dá)的Gam蛋白抑制了宿主RecBCD的所有外切酶活性。然后通過自身表達(dá)的λ核酸外切酶和β蛋白完成兩條發(fā)生同源重組的dsDNA的斷裂和復(fù)合,剩余重組步驟在宿主蛋白的作用下完成。當(dāng)發(fā)生重組的兩條dsDNA都有斷裂切口,且不在同一位點(diǎn)時(shí),Red重組系統(tǒng)將以退火的形式促進(jìn)兩條dsDNA的斷裂和復(fù)合(圖1右):λ核酸外切酶結(jié)合到兩條dsDNA的切口末端,自5′末端向內(nèi)切割DNA,留下游離的3′末端,在β蛋白的介導(dǎo)下兩條雙鏈DNA的單鏈區(qū)發(fā)生退火,缺口在連接酶作用下重新連接,形成新的DNA分子。當(dāng)發(fā)生重組的兩條dsDNA中只有一條斷裂,另一保持完整時(shí),重組將以侵入的形式進(jìn)行(圖1左):λ核酸外切酶結(jié)合到斷裂的dsDNA的切口處,酶切形成游離3′單鏈DNA區(qū)段。在RecA、β蛋白和一些其他因子的共同作用下,3′單鏈DNA區(qū)段侵入到另一dsDNA分子的因局部解鏈而產(chǎn)生的單鏈泡中。形成三鏈結(jié)合(threestrandedjunction),再在RecQ解螺旋酶的作用下發(fā)生分支遷移,形成異源雙鏈(heteroduplex),進(jìn)而在內(nèi)切核酸酶作用下形成Hollidayjunction,RuvC把連鎖在一起的兩條DNA分子分開,修復(fù)錯(cuò)配的堿基后形成同源雙鏈(homoduplex),同源重組完成。因此該重組方式又被稱為分支遷移——異源雙鏈形成——錯(cuò)配修復(fù)途徑(migeration-heroduplexformation-mismatchrepairpathway)。3roin重組病毒的敲除Ellis、Court和Stewart等研究發(fā)現(xiàn)在Red系統(tǒng)的bet基因作用下可以啟動(dòng)E.coli染色體和短的單鏈寡核苷酸序列間發(fā)生重組,導(dǎo)致基因的敲除或置換,因此目前廣泛用于原核生物的基因敲除。Red重組系統(tǒng)相對(duì)于宿主菌來說是一個(gè)外來的功能單位,其重組蛋白表達(dá)時(shí)在宿主菌內(nèi)誘導(dǎo)形成“hyper-rac”狀態(tài),這種狀態(tài)將對(duì)宿主菌本身的同源重組系統(tǒng)產(chǎn)生影響,從而對(duì)菌體本身造成傷害。因此必須對(duì)Red重組系統(tǒng)的表達(dá)進(jìn)行控制。一種方法是將λred基因克隆到低拷貝質(zhì)粒,在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下適量表達(dá)。Datsenko和Wanner構(gòu)建了一個(gè)Red輔助質(zhì)粒,包含araC-ParaB啟動(dòng)子和gam、bet和exo三基因片段。由于質(zhì)粒上具有核糖體結(jié)合位點(diǎn),在阿拉伯糖誘導(dǎo)下Red蛋白可以有效的轉(zhuǎn)錄表達(dá),同時(shí)它還是一個(gè)溫度敏感型復(fù)制子,當(dāng)實(shí)驗(yàn)中不需要時(shí)可以不讓其表達(dá)。另外一技術(shù)是將E.coli的recC-ptr-recB-recD基因簇與red基因置換。置換后的菌株,在敲除已知E.coli的重組基因的同時(shí)保持菌株的活力,而且細(xì)胞不再承受攜帶red基因的輔助質(zhì)粒。DaiguanYu等發(fā)展了這一技術(shù),利用溫度敏感性λcI抑制子控制λ原噬菌體PL操縱子,從而使exo、bet和gam基因在42℃時(shí)表達(dá),32℃時(shí)終止。從而保證了Red重組系統(tǒng)在宿主菌中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),完成靶向基因的敲除,同時(shí)也不會(huì)或減少了對(duì)宿主菌本身重組系統(tǒng)的影響。圖2描述了在Red重組系統(tǒng)介導(dǎo)下基因敲除的過程。先合成一對(duì)引物,每一條引物的5′端有35～60bp與靶基因同源,3′端與篩選基因(例如抗藥性基因)同源,以抗藥性質(zhì)粒為模板,通過PCR獲得中間為一個(gè)篩選基因,其兩端為35～60bp同源臂(圖2中A和B)的線性打靶DNA,有時(shí)在篩選基因和同源臂間還含有特異性重組位點(diǎn)(SSRTs,site-specificrecombinastionsites)或者限制性酶切位點(diǎn)序列。將線性打靶DNA電擊轉(zhuǎn)化到含有Red重組系統(tǒng)的宿主菌后,Red重組系統(tǒng)適量表達(dá),λ核酸外切酶結(jié)合到線性打靶DNA兩同源臂末端,酶切產(chǎn)生游離3′單鏈DNA區(qū)段,從而使兩同源臂和宿主染色體間以鏈侵入的方式發(fā)生重組。線性打靶DNA插入到同源臂A和B間,而宿主染色體上A和B間的DNA序列被其置換,從而完成了對(duì)靶分子的定向敲除,得到靶基因缺失的突變體。但是這些缺失突變體中還存在篩選基因(通常是抗藥性基因),在構(gòu)建基因工程菌苗等研究中,都需要去除。去除的方法主要依賴于線性打靶DNA的設(shè)計(jì)。一種方法是在同源臂間插入研究者感興趣的基因,將這種線性打靶DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主后,通過同源重組,感興趣的基因代替原來的篩選基因。另一種方法是在線性打靶DNA的篩選基因和同源臂間插入特異性重組位點(diǎn),發(fā)生同源重組后,重組子的染色體上同樣有特異性重組位點(diǎn),這樣在相應(yīng)位點(diǎn)特異性重組酶(Cre或Flp)的作用下去除篩選基因,只在作用位點(diǎn)留下單一的SSRT。此外,在線性打靶DNA的篩選基因和同源臂間有限制性酶切位點(diǎn),用相應(yīng)的限制性酶酶切并重新連接,得到不含有篩選基因的重組子。4遇到的問題和解決方法在實(shí)際應(yīng)用Red重組系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除的過程中可能會(huì)遇到一些具體的問題,下面就根據(jù)筆者的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)簡(jiǎn)要總結(jié)如下。1稀釋液二次pcr法基因敲除所用的線性打靶DNA的PCR模板通常是質(zhì)粒,該質(zhì)粒本身具有篩選重組子的抗藥性基因?？梢园训谝淮蜳CR的產(chǎn)物稀釋1000倍,然后以稀釋液為模板進(jìn)行二次PCR,用第二次PCR產(chǎn)物去轉(zhuǎn)化宿主菌,可大大減少假陽性。也可以利用DpnI消化處理PCR產(chǎn)物,DpnI只作用甲基化的底物,大多數(shù)從常用菌株提取的質(zhì)粒都被甲基化,而PCR得到的線性DNA沒有甲基化,這樣DpnI限制性內(nèi)切酶專一性地降解模板質(zhì)粒,而且DpnI的識(shí)別序列只有4個(gè)核苷酸殘基,在DNA分子中出現(xiàn)的頻率高,模板質(zhì)?？杀煌耆到?。2轉(zhuǎn)化效率不高為提高電擊轉(zhuǎn)化效率,電擊用的感受態(tài)細(xì)胞的制備是一個(gè)需要注意的問題。如果OD600值過低或過高都會(huì)使轉(zhuǎn)化效率降低,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。根據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)體會(huì)及文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的濃度一般在OD600于0.35～0.60間為佳,制備后感受態(tài)的終濃度在2～5×1010cells/mL為好,電擊前置于冰上。3線性打靶的dna同源臂和序列的確定當(dāng)線性打靶DNA的同源臂設(shè)計(jì)不當(dāng)時(shí),會(huì)造成基因的錯(cuò)誤敲除。因此線性打靶DNA同源臂的長(zhǎng)短以及序列的確定要根據(jù)不同的靶基因進(jìn)行選擇。避免同源臂在靶基因所在基因上或靶基因本身上有多個(gè)同源序列,造成非必要的同源重組。4抗藥性基因篩選有時(shí)在篩選平板上長(zhǎng)出的抗性克隆,當(dāng)被轉(zhuǎn)入液體篩選培養(yǎng)基時(shí)便不能生長(zhǎng)。這里線性DNA瞬時(shí)表達(dá)了抗生素抗性蛋白導(dǎo)致了這一現(xiàn)象的出現(xiàn),由于線性DNA攜帶供篩選用抗藥性基因及其啟動(dòng)子,即使線性DNA沒有整合進(jìn)環(huán)形靶分子,也可以短暫表達(dá)篩選蛋白。為了使假抗性克隆的絕對(duì)數(shù)量保持在最低限度,電擊后在無抗生素選擇壓力的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時(shí)間盡量縮短。5基于roth的基因整合和基因敲除以Red重組系統(tǒng)為基礎(chǔ)的基因敲除是最近研究較熱的技術(shù)方法,對(duì)研究微生物基因的功能具有重要的促進(jìn)作用。因?yàn)樗c傳統(tǒng)的基因敲除方法相比,重組效率明顯提高,Muyrers在實(shí)驗(yàn)中利用Red重組系統(tǒng)時(shí)獲得的候選株80%是正確的重組子。Swaminathan也在其一篇論文中闡述了利用Red重組可達(dá)到較高的成功率,而且無需采用篩選基因即可鑒定正確的重組子。而且此方法利用線性打靶DNA,不需構(gòu)建打靶質(zhì)粒,因此實(shí)驗(yàn)周期大大縮短。但到目前為止,此系統(tǒng)還主要應(yīng)用于大腸桿菌的基因整合和敲除,在其它菌株獲得成功的實(shí)例較少。Kofoid和Roth在沙門氏菌(Salmonella),Murohy在腸致病性大腸桿菌(enteropathogenicE.coli)和腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagicE.coli)中應(yīng)用Red系統(tǒng)進(jìn)行基因置換,但所用的同源臂長(zhǎng)度達(dá)數(shù)百堿基或更長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)室王恒等在福氏2a痢疾桿菌