基因表達與功能基因?qū)W

基因表達與功能基因?qū)W

自1995年出版以來，已經(jīng)完成了42種微生物遺傳因素的篩選，包括桿菌和腸球菌。這些全基因組序列的測定為進一步研究各種微生物的基因功能奠定了基礎(chǔ)。研究基因功能的重要方法之一是構(gòu)建基因的突變體來檢測其表型的變化,以推測某個基因在生長過程中起到怎樣的作用。最直接的方法是將目的基因敲除,這樣可以保證被研究的基因完全失活。微生物基因敲除的傳統(tǒng)方法是利用微生物本身的RecA重組系統(tǒng)。RecA重組系統(tǒng)是大腸桿菌內(nèi)源性的同源重組機構(gòu),它由RecA和RecBCD組成。RecA蛋白促進各類DNA分子間的同源聯(lián)會、配對以及鏈交換和分支遷移。RecBCD分子量較大、是一個由RecB,RecC和RecD組成的復(fù)合體,功能多樣,是ATP依賴的外切酶V和解旋酶,它與雙鏈切口結(jié)合,解開DNA并在Chi位點產(chǎn)生單鏈DNA,繼而由RecA蛋白促進同源重組。由于RecBCD具有核酸外切酶V的活性,所以線性DNA分子在細菌體內(nèi)會被降解,必須要以環(huán)形的質(zhì)粒狀態(tài)存在才能不被分解。而且必須將靶基因兩側(cè)至少200bp的DNA序列克隆至自殺質(zhì)粒上,并在其中間插入抗藥性基因。通過結(jié)合轉(zhuǎn)移,依靠RecA同源重組系統(tǒng)將自殺質(zhì)粒整合于細菌的染色體上。整合于染色體上的自殺質(zhì)粒又可以發(fā)生第二次同源重組,重組的結(jié)果會有兩種可能:一是把目的基因敲除,通過抗藥性基因的篩選,就可以篩選到二次重組子(即基因敲除的缺失突變體);另一種情況是回復(fù)為原始的分子狀態(tài)。利用RecA重組進行的基因敲除為研究微生物基因的功能奠定了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。應(yīng)用較廣的主要有定點突變、變性雙鏈法實現(xiàn)基因敲除等技術(shù)。但是以RecA重組為基礎(chǔ)的基因敲除具有較大的不足之處。首先是需要較長的靶基因同源臂,且必須構(gòu)建具有靶位點的打靶質(zhì)粒。另外是RecA重組發(fā)生幾率很低,很難獲得所需要的重組子。近來由Murphy和Stewart等人用噬菌體λ的Red重組系統(tǒng)在大腸桿菌中建立的快速敲除原核基因的方法簡化了實驗操作,使實驗周期大大縮短。下面對Red重組系統(tǒng)的組成、重組機理及在微生物基因敲除中的應(yīng)用做一綜述。1蛋白及gam基因的結(jié)構(gòu)特點Red重組系統(tǒng)屬于λ噬菌體的重組系統(tǒng),其編碼基因exo、bet和gam置于PL操縱子的控制之下。exo基因的產(chǎn)物是λ核酸外切酶,它可將dsDNA5′端切開,產(chǎn)生3′端突出。由結(jié)晶學(xué)研究發(fā)現(xiàn),該核酸外切酶在溶液中是環(huán)形三聚體,具有一個到達中心的通道,一端可以調(diào)節(jié)dsDNA,另一端調(diào)節(jié)ssDNA。bet基因編碼的β蛋白,可與ssDNA結(jié)合促進互補鏈的復(fù)性,并可以介導(dǎo)DNA鏈退火和交換反應(yīng)。它在溶液中的游離狀態(tài)為環(huán)狀物,當(dāng)結(jié)合到ssDNA時形成大的環(huán)狀物,當(dāng)結(jié)合到dsDNA時形成螺旋狀纖維。這些結(jié)構(gòu)特點揭示了β蛋白屬于重組蛋白家族中的一員,該家族包括Salmonella噬菌體P22的Erf蛋白,E.coli隱蔽型原噬菌體Rac的RecT蛋白,真核生物的Rad52蛋白。β蛋白與λ核酸外切酶形成復(fù)合物,調(diào)節(jié)核酸溶解(nucleolytic)和重組啟動。gam基因的產(chǎn)物是一個分子量為16000Da的多肽,結(jié)合到宿主的RecBCD蛋白,形成二聚體,抑制RecBCD的外切酶活性。另外E.coli隱蔽型原嗜菌體Rac的重組系統(tǒng)與Red重組系統(tǒng)相似。前者的recE與exo相似,編碼一種核酸外切酶;recT與bet相似,編碼一種結(jié)合于ssDNA促使鏈交換的蛋白。二者的重組機理相同,可以說是同一類重組系統(tǒng)。2同源重組ssd-pcr檢測有關(guān)λ噬菌體重組系統(tǒng)方面的研究已有數(shù)十年的歷史,自上世紀(jì)60年代始,就有人報導(dǎo)λ編碼的產(chǎn)物可以促進細菌發(fā)生重組,Clark和他的同事發(fā)現(xiàn)具有λRed系統(tǒng)的菌株在同源重組時不依賴細菌本身的重組系統(tǒng)。因而認為Red重組是一個獨立的重組系統(tǒng)。其重組的分子機制如下:同源重組涉及到參與重組的兩條dsDNA的斷裂和復(fù)合。在Red重組系統(tǒng)中,該系統(tǒng)表達的Gam蛋白抑制了宿主RecBCD的所有外切酶活性。然后通過自身表達的λ核酸外切酶和β蛋白完成兩條發(fā)生同源重組的dsDNA的斷裂和復(fù)合,剩余重組步驟在宿主蛋白的作用下完成。當(dāng)發(fā)生重組的兩條dsDNA都有斷裂切口,且不在同一位點時,Red重組系統(tǒng)將以退火的形式促進兩條dsDNA的斷裂和復(fù)合(圖1右):λ核酸外切酶結(jié)合到兩條dsDNA的切口末端,自5′末端向內(nèi)切割DNA,留下游離的3′末端,在β蛋白的介導(dǎo)下兩條雙鏈DNA的單鏈區(qū)發(fā)生退火,缺口在連接酶作用下重新連接,形成新的DNA分子。當(dāng)發(fā)生重組的兩條dsDNA中只有一條斷裂,另一保持完整時,重組將以侵入的形式進行(圖1左):λ核酸外切酶結(jié)合到斷裂的dsDNA的切口處,酶切形成游離3′單鏈DNA區(qū)段。在RecA、β蛋白和一些其他因子的共同作用下,3′單鏈DNA區(qū)段侵入到另一dsDNA分子的因局部解鏈而產(chǎn)生的單鏈泡中。形成三鏈結(jié)合(threestrandedjunction),再在RecQ解螺旋酶的作用下發(fā)生分支遷移,形成異源雙鏈(heteroduplex),進而在內(nèi)切核酸酶作用下形成Hollidayjunction,RuvC把連鎖在一起的兩條DNA分子分開,修復(fù)錯配的堿基后形成同源雙鏈(homoduplex),同源重組完成。因此該重組方式又被稱為分支遷移——異源雙鏈形成——錯配修復(fù)途徑(migeration-heroduplexformation-mismatchrepairpathway)。3roin重組病毒的敲除Ellis、Court和Stewart等研究發(fā)現(xiàn)在Red系統(tǒng)的bet基因作用下可以啟動E.coli染色體和短的單鏈寡核苷酸序列間發(fā)生重組,導(dǎo)致基因的敲除或置換,因此目前廣泛用于原核生物的基因敲除。Red重組系統(tǒng)相對于宿主菌來說是一個外來的功能單位,其重組蛋白表達時在宿主菌內(nèi)誘導(dǎo)形成“hyper-rac”狀態(tài),這種狀態(tài)將對宿主菌本身的同源重組系統(tǒng)產(chǎn)生影響,從而對菌體本身造成傷害。因此必須對Red重組系統(tǒng)的表達進行控制。一種方法是將λred基因克隆到低拷貝質(zhì)粒,在誘導(dǎo)型啟動子控制下適量表達。Datsenko和Wanner構(gòu)建了一個Red輔助質(zhì)粒,包含araC-ParaB啟動子和gam、bet和exo三基因片段。由于質(zhì)粒上具有核糖體結(jié)合位點,在阿拉伯糖誘導(dǎo)下Red蛋白可以有效的轉(zhuǎn)錄表達,同時它還是一個溫度敏感型復(fù)制子,當(dāng)實驗中不需要時可以不讓其表達。另外一技術(shù)是將E.coli的recC-ptr-recB-recD基因簇與red基因置換。置換后的菌株,在敲除已知E.coli的重組基因的同時保持菌株的活力,而且細胞不再承受攜帶red基因的輔助質(zhì)粒。DaiguanYu等發(fā)展了這一技術(shù),利用溫度敏感性λcI抑制子控制λ原噬菌體PL操縱子,從而使exo、bet和gam基因在42℃時表達,32℃時終止。從而保證了Red重組系統(tǒng)在宿主菌中進行瞬時表達,完成靶向基因的敲除,同時也不會或減少了對宿主菌本身重組系統(tǒng)的影響。圖2描述了在Red重組系統(tǒng)介導(dǎo)下基因敲除的過程。先合成一對引物,每一條引物的5′端有35～60bp與靶基因同源,3′端與篩選基因(例如抗藥性基因)同源,以抗藥性質(zhì)粒為模板,通過PCR獲得中間為一個篩選基因,其兩端為35～60bp同源臂(圖2中A和B)的線性打靶DNA,有時在篩選基因和同源臂間還含有特異性重組位點(SSRTs,site-specificrecombinastionsites)或者限制性酶切位點序列。將線性打靶DNA電擊轉(zhuǎn)化到含有Red重組系統(tǒng)的宿主菌后,Red重組系統(tǒng)適量表達,λ核酸外切酶結(jié)合到線性打靶DNA兩同源臂末端,酶切產(chǎn)生游離3′單鏈DNA區(qū)段,從而使兩同源臂和宿主染色體間以鏈侵入的方式發(fā)生重組。線性打靶DNA插入到同源臂A和B間,而宿主染色體上A和B間的DNA序列被其置換,從而完成了對靶分子的定向敲除,得到靶基因缺失的突變體。但是這些缺失突變體中還存在篩選基因(通常是抗藥性基因),在構(gòu)建基因工程菌苗等研究中,都需要去除。去除的方法主要依賴于線性打靶DNA的設(shè)計。一種方法是在同源臂間插入研究者感興趣的基因,將這種線性打靶DNA轉(zhuǎn)化進宿主后,通過同源重組,感興趣的基因代替原來的篩選基因。另一種方法是在線性打靶DNA的篩選基因和同源臂間插入特異性重組位點,發(fā)生同源重組后,重組子的染色體上同樣有特異性重組位點,這樣在相應(yīng)位點特異性重組酶(Cre或Flp)的作用下去除篩選基因,只在作用位點留下單一的SSRT。此外,在線性打靶DNA的篩選基因和同源臂間有限制性酶切位點,用相應(yīng)的限制性酶酶切并重新連接,得到不含有篩選基因的重組子。4遇到的問題和解決方法在實際應(yīng)用Red重組系統(tǒng)進行基因敲除的過程中可能會遇到一些具體的問題,下面就根據(jù)筆者的實驗經(jīng)驗簡要總結(jié)如下。1稀釋液二次pcr法基因敲除所用的線性打靶DNA的PCR模板通常是質(zhì)粒,該質(zhì)粒本身具有篩選重組子的抗藥性基因?？梢园训谝淮蜳CR的產(chǎn)物稀釋1000倍,然后以稀釋液為模板進行二次PCR,用第二次PCR產(chǎn)物去轉(zhuǎn)化宿主菌,可大大減少假陽性。也可以利用DpnI消化處理PCR產(chǎn)物,DpnI只作用甲基化的底物,大多數(shù)從常用菌株提取的質(zhì)粒都被甲基化,而PCR得到的線性DNA沒有甲基化,這樣DpnI限制性內(nèi)切酶專一性地降解模板質(zhì)粒,而且DpnI的識別序列只有4個核苷酸殘基,在DNA分子中出現(xiàn)的頻率高,模板質(zhì)?？杀煌耆到?。2轉(zhuǎn)化效率不高為提高電擊轉(zhuǎn)化效率,電擊用的感受態(tài)細胞的制備是一個需要注意的問題。如果OD600值過低或過高都會使轉(zhuǎn)化效率降低,導(dǎo)致實驗的失敗。根據(jù)筆者的經(jīng)驗體會及文獻報導(dǎo),發(fā)現(xiàn)細胞的濃度一般在OD600于0.35～0.60間為佳,制備后感受態(tài)的終濃度在2～5×1010cells/mL為好,電擊前置于冰上。3線性打靶的dna同源臂和序列的確定當(dāng)線性打靶DNA的同源臂設(shè)計不當(dāng)時,會造成基因的錯誤敲除。因此線性打靶DNA同源臂的長短以及序列的確定要根據(jù)不同的靶基因進行選擇。避免同源臂在靶基因所在基因上或靶基因本身上有多個同源序列,造成非必要的同源重組。4抗藥性基因篩選有時在篩選平板上長出的抗性克隆,當(dāng)被轉(zhuǎn)入液體篩選培養(yǎng)基時便不能生長。這里線性DNA瞬時表達了抗生素抗性蛋白導(dǎo)致了這一現(xiàn)象的出現(xiàn),由于線性DNA攜帶供篩選用抗藥性基因及其啟動子,即使線性DNA沒有整合進環(huán)形靶分子,也可以短暫表達篩選蛋白。為了使假抗性克隆的絕對數(shù)量保持在最低限度,電擊后在無抗生素選擇壓力的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時間盡量縮短。5基于roth的基因整合和基因敲除以Red重組系統(tǒng)為基礎(chǔ)的基因敲除是最近研究較熱的技術(shù)方法,對研究微生物基因的功能具有重要的促進作用。因為它與傳統(tǒng)的基因敲除方法相比,重組效率明顯提高,Muyrers在實驗中利用Red重組系統(tǒng)時獲得的候選株80%是正確的重組子。Swaminathan也在其一篇論文中闡述了利用Red重組可達到較高的成功率,而且無需采用篩選基因即可鑒定正確的重組子。而且此方法利用線性打靶DNA,不需構(gòu)建打靶質(zhì)粒,因此實驗周期大大縮短。但到目前為止,此系統(tǒng)還主要應(yīng)用于大腸桿菌的基因整合和敲除,在其它菌株獲得成功的實例較少。Kofoid和Roth在沙門氏菌(Salmonella),Murohy在腸致病性大腸桿菌(enteropathogenicE.coli)和腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagicE.coli)中應(yīng)用Red系統(tǒng)進行基因置換,但所用的同源臂長度達數(shù)百堿基或更長。本實驗室王恒等在福氏2a痢疾桿菌