竹柏葉hplc特征指紋圖譜研究

竹柏葉hplc特征指紋圖譜研究

竹柏樹又稱紅松、羅漢柴、椰子、山腳下、鐵甲樹等。這是羅漢松科的一種常見樹種，分布在廣東省南部，生長于廣東省大部分地區(qū)。近年來,竹柏的抗腫瘤作用日漸引起人們的注意,在竹柏的分類學(xué)和葉的揮發(fā)油方面也進(jìn)行了一些研究,竹柏種子中所含竹柏內(nèi)酯A、1-去氧-2β∶3β-環(huán)氧竹柏內(nèi)酯A、1-去氧-2α-羥基竹柏內(nèi)酯A有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用,此外,筆者參與了竹柏類植物的生藥學(xué)相關(guān)研究。竹柏除了含揮發(fā)油外,其黃酮類成分也是最主要的有效成分。黃酮類成分包括穗花杉雙黃酮、金松雙黃酮等,其中穗花杉雙黃酮的含量在竹柏葉化學(xué)成分中含量較高。本研究以穗花杉雙黃酮作為對照品,采用超聲醇溶液提取,對采集到的8批竹柏葉中的醇提物進(jìn)行特征圖譜研究,并應(yīng)用國家藥典委員會推薦的分析軟件,對8個(gè)樣品中的醇溶成分進(jìn)行中藥指紋圖譜鑒別分析。初步得到不同批次竹柏葉中醇溶部分各成分的相對含量狀況,現(xiàn)報(bào)道如下。1材料表面1.1儀器和試劑盒2方法和結(jié)果2.1儀器、試藥和儀器BS124S電子分析天平和BS211p電子分析天平(德國Sartorius公司);HWS-28電動恒溫水浴鍋(上海一恒電子儀器廠);Agilent1100高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司);TCQ-250型超聲清洗器(北京醫(yī)療設(shè)備二廠)。穗花杉雙黃酮對照品由廣東省中醫(yī)研究所提供,純度為99.8%;乙腈為色譜純,磷酸、甲醇等均為分析純,水為三蒸水。1.2檢測部位和溫度竹柏采集于廣東省廣州市,原植物經(jīng)蔡岳文主任中藥師鑒定分別為羅漢松科竹柏Podocarpusnagi(Thun.)ZolletMor和長葉竹柏。采集部位為葉,采集時(shí)間為2007年10月30日。AgilentHypersilODSC18柱(4.6mm×150mm,5μm);以乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動相,梯度洗脫,乙腈由15%~100%;洗脫時(shí)間30min,檢測波長為310nm。流速1.0mL/min,柱溫20℃。理論塔板數(shù)按穗花杉雙黃酮計(jì)應(yīng)不低于5000。2.2供試品溶液的制備取藥材樣品,剪碎,取約0.5g,精密稱定,置50mL具塞錐形瓶中,加體積分?jǐn)?shù)50%乙醇10mL,稱質(zhì)量,超聲提取30min,取出,置冷,稱質(zhì)量,補(bǔ)足損失的質(zhì)量,搖勻,用0.22μm微孔濾膜濾過,濾液做為供試品溶液。2.3對照溶液的制備精密稱取穗花杉雙黃酮對照品適量,加甲醇溶解,配制成濃度為0.013mg/mL的對照品溶液。2.4方法研究2.4.1精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果取同一供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,其相對保留時(shí)間穩(wěn)定,主要共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(sR)均小于2.9%,結(jié)果表明精密度較好。2.4.2供試品溶液穩(wěn)定性取同一供試品溶液,分別于0、1、2、3、4、24h檢測,其相對保留時(shí)間穩(wěn)定,主要共有峰相對保留時(shí)間sR和相對峰面積sR均小于3.2%,結(jié)果表明供試品溶液24h內(nèi)穩(wěn)定性好。2.4.3重現(xiàn)性測定取同一樣品號的供試品6份,分別處理測定,其相對保留時(shí)間穩(wěn)定,主要共有峰相對保留時(shí)間sR和相對峰面積sR均小于3.6%,結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。2.5結(jié)果2.5.1指紋圖譜的建立指紋圖譜建立的原則應(yīng)從色譜的整體性出發(fā),確定能構(gòu)成指紋圖譜的色譜峰的峰號、峰位、峰數(shù)。經(jīng)比較所有測定和記錄的色譜圖,確定竹柏葉樣品的共有峰組成其指紋圖譜,同時(shí)找出主要特征指紋峰。對照品、供試品HPLC圖譜見圖1。2.5.2指紋色譜檢測按供試品制備方法分別對竹柏葉(8個(gè)樣品)進(jìn)行處理測定,以穗花杉雙黃酮對照品峰(S)為參照峰(見圖1),分別進(jìn)行指紋色譜峰標(biāo)號,標(biāo)示出8個(gè)竹柏藥材有21個(gè)共有峰,見圖2。2.5.3指紋圖譜的特征以穗花杉雙黃酮色譜峰(保留時(shí)間RT為12.01min)為標(biāo)準(zhǔn)峰,對各個(gè)樣品指紋色譜進(jìn)行分析。在竹柏葉方面,從保留時(shí)間上看,8個(gè)竹柏葉樣品指紋圖譜相似程度很高,共有峰有21個(gè);從整個(gè)圖譜看,各個(gè)色譜峰分離度高,基線平,色譜峰特征性強(qiáng),8個(gè)竹柏葉樣品指紋圖譜圖貌比較相似,特別是在第二區(qū)間(RT=10.00~25.00min)。但不同樣品之間也存在差異,主要表現(xiàn)在第一區(qū)間(RT=1.00~10.00min)。2.5.4.1.竹白葉8個(gè)樣品的指紋相似性分析圖3(見彩圖頁第497頁)結(jié)果顯示:指紋圖譜相似程度很高,特別是在第二區(qū)間(RT=10.00~25.00min)。2.5.4.2.竹白葉8個(gè)樣品的指紋相似度分析以13號峰(穗花杉雙黃酮峰)為參照,得各峰值及均值,結(jié)果見表1、表2。3討論3.1色譜柱的分離和色譜經(jīng)試驗(yàn)比較,以乙腈—體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸水溶液為流動相,梯度洗脫能夠較好地使竹柏葉樣品中各色譜峰分離,且出峰最多,基線較平,分析時(shí)間30min。3.2指紋圖譜的確定考察了不同波長如280、310、340nm等的指紋圖譜,同時(shí)還對數(shù)批樣品進(jìn)行測定,結(jié)果表明:不同波長指紋圖譜存在差異,以280nm的指紋圖譜所得信息最多,但基線不夠平整;而310nm和340nm的色譜圖則較為平整,且吸收峰分離度好,塔板數(shù)均很高,尤以310nm的分析圖譜最好。3.3洗脫條件及洗脫效率由于梯度洗脫能改善峰分離程度,對不同洗脫梯度進(jìn)行考察,結(jié)果表明:以上述洗脫條件最好。柱溫對分離影響也很大,經(jīng)過考察,柱溫以25℃為最佳。3.4相關(guān)系數(shù)的比較8批竹柏葉樣品HCLP圖譜中,共有峰有21個(gè),指紋圖譜相似程度很高,但不同樣品之間也存在差異,主要表現(xiàn)在第一區(qū)間(RT=1.00~10.00min)。從中位數(shù)相似度評價(jià)看,竹柏葉指紋圖譜相關(guān)系數(shù)(中位數(shù))和相合系數(shù)(中位數(shù))均在0.9000以上,除了個(gè)別較低[竹柏葉6相關(guān)系數(shù)(中位數(shù))為0.8913,竹柏葉2相合系數(shù)(中位數(shù))為0.8544]外。同樣,從均值相似度評價(jià)看,竹柏葉指紋圖譜相關(guān)系數(shù)(均值)和相合系數(shù)(均值),除了竹柏葉2相合系數(shù)(均值)為0.8735外,也均在0.9000以上。指紋圖譜相似度評價(jià)結(jié)果顯示:8批竹柏葉之間指紋圖譜相似度較高,達(dá)到了0.9以上,表明指紋圖譜可做為竹柏葉的鑒別特征和質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)之一。竹柏葉分布廣泛,生長周期也長,本研究對其指紋圖譜研究所用樣品仍不夠多,因此,