甘蔗rapd標(biāo)記特異性片段的設(shè)計與scar標(biāo)記轉(zhuǎn)化

甘蔗rapd標(biāo)記特異性片段的設(shè)計與scar標(biāo)記轉(zhuǎn)化

甘蔗是世界上最重要的糖資源之一，其遺傳背景非常復(fù)雜。甘蔗屬（Saccharum）內(nèi)分為熱帶種（S.officinarum）、印度種（S.barberi）、中國種（S.sinense）、割手密種（S.spontaneum）、大莖野生種（S.robusfum）等多個原始野生種（彭紹光，1985）。現(xiàn)代甘蔗栽培品種均是經(jīng)種間雜交育成的含有為2～5個種的血緣復(fù)雜多倍體。因此，尋找甘蔗親本種特異DNA序列，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成為特異PCR標(biāo)記，將可作為甘蔗種質(zhì)鑒定及遠(yuǎn)緣雜交種鑒定的有效工具。近年來，植物特異DNA序列的篩選與應(yīng)用己取得進(jìn)展，并已應(yīng)用在鑒定外源染色體的來源、種質(zhì)鑒定、外源染色體的識別以及有關(guān)基因組研究等方面（王英等，2007；莊南生和鄭成木，2002）。而有關(guān)甘蔗種質(zhì)的特異DNA序列的研究與應(yīng)用的報道很少（Selvetal.,2003；莊南生等，2004），至今尚未見利用隨機(jī)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(randomfragmentlengthpolymorphism,RAPD)的片段構(gòu)建甘蔗祖親種特異PCR的報道。RAPD分子標(biāo)記是Williamsetal.(1990)和Welshetal.(1990)發(fā)明的一種技術(shù)。以PCR技術(shù)原理為基礎(chǔ)的RAPD標(biāo)記以其操作簡單、經(jīng)濟(jì)快捷等優(yōu)點在種質(zhì)鑒定、種質(zhì)資源評估以及遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析上得到了較為廣泛的應(yīng)用，但重復(fù)性和穩(wěn)定性較差是RAPD標(biāo)記較難克服的缺陷。將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化成序列特征性片段擴(kuò)增區(qū)域(sequencecharacterizedamplifiedregion,SCAR)標(biāo)記，進(jìn)行種、屬的快速鑒定(Lahgueetal.,1998)。SCAR標(biāo)記其特異性和穩(wěn)定性均比RAPD的大幅度提高（黃朝峰等，2000），目前已在很多的作物如水稻（向太和等，2003）、麥類（黃朝峰等，2000）、大豆、油菜以及一些觀賞植物與果蔬如草莓（Albanietal.，2004；王志剛等，2007）、桃（吳俊等，2004）等研究中，用此技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)分類、種質(zhì)鑒定及相關(guān)性狀連鎖基因克隆等方面的研究（吳俊等，2004；郭立海等，2002;Hermosaetal.，2001；賈繼增，1996）。本研究利用RAPD特異片段轉(zhuǎn)化成甘蔗祖親種特異SCAR標(biāo)記，旨在為甘蔗種質(zhì)鑒定及遠(yuǎn)緣雜交的雜種鑒定提供基礎(chǔ)資料。1材料和方法1.1原種和屬種種供試的甘蔗種質(zhì)共96份。其中39份祖親種包括熱帶種(Saccharumofficinarum)、印度種(S.barberi)、割手密種(S.spontaneum)、大莖野生種(S.robustum)、中國種(S.sinense)、斑茅（Erianthusarundinaceus）和河八王原種；其它57份為雜種F，或栽培品種(表1)。那高利、Nagans、Pansahi、57NG208及云南割手密系列引自云南甘蔗育種研究所，其余材料均引自中國輕工總會甘蔗糖業(yè)研究所海南甘蔗育種場。各種質(zhì)的血緣是根據(jù)其育種系譜查證而確定的（彭紹光，1985）。1.2方法1.2.1ctag法用于提取遺傳因子的總dna王英等人，20081.2.2rapp試驗程序1.2.2.rapd片段的篩選參照曾華宗等（2003），對多態(tài)性豐富的25條RAPD引物以12份親本種進(jìn)行特異RAPD引物篩選，獲得了最有可能找出甘蔗親本種種特異帶的3條引物S418、S1367及S427，進(jìn)而選用36份親本種質(zhì)用這3條引物分別進(jìn)行RAPD標(biāo)記，用于篩選甘蔗祖親種特異RAPD片段。所用的引物序列為：1.2.2.pcr反應(yīng)程序PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為20μL,包括10×Buffer2.0μL,模板DNA(10ng/μL)2.0μL,MgCl2(25mmol/L)2.0μL,dNTPs(2mmol/L)2.0μL,引物(5μmol/L)2.0μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.3μL,ddH2O到20μL;擴(kuò)增反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min后,94℃變性7min,38℃退火1min,72℃延伸90s,45個循環(huán);72℃延伸5min。采用1.5%瓊脂糖凝膠(加入EB使其終濃度為0.5μg/mL)電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。1.3rapd標(biāo)記系統(tǒng)的純化用手術(shù)刀片刮下凝膠中的特異條帶并置于1.5mL離心管內(nèi)，根據(jù)試劑盒說明采用鼎國公司生產(chǎn)的DNA快速純化/回收試劑盒進(jìn)行RAPD標(biāo)記特異條帶的回收及純化。1.4陽性克隆的篩選、克隆測序用華美生產(chǎn)的大腸桿菌（Escherichiacoli)DH5α制備感受態(tài)細(xì)胞，采用上海生工生產(chǎn)的pUCm-T克隆試劑盒進(jìn)行片段的連接后并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在表層含有X-gal(BBI）和IPTG(BBI）添加有Amp(AMRESCO）的LB(Sangon）培養(yǎng)基上進(jìn)行陽性克隆的篩選，經(jīng)PCR檢測（方法同1.2.2.2，不同處在預(yù)變性10min）后確定為陽性克隆的，再挑單克隆進(jìn)行固體穿刺培養(yǎng)后，由上海生工完成測序。2結(jié)果和分析2.1甘蔗rapd擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增和測序?qū)?5條RAPD引物的特異RAPD篩選，其中12份甘蔗親本種基因組包括熱帶種黑車?yán)锉九c拔地拉，割手密種崖城割手密與印度割手密，印度種春尼與那高利，大莖野生種NG77/001與NG77/004，中國種育巴和廣西竹蔗，斑茅種崖城斑茅2號和紅花斑茅。經(jīng)檢測、篩選，獲得了最有可能找出甘蔗親本種種特異帶的3條引物S418、S1367及S427。再用這3條引物分別對36份親本種基因組DNA進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，用于篩選甘蔗親本種特異RAPD片段。在甘蔗屬中，熱帶種、割手密種和印度種是雜交育種中最重要的親本種，而黑車?yán)锉荆釒ХN）、印度割手密（割手密）、春尼（印度種），是親本種中最常用的種質(zhì)，以至多數(shù)現(xiàn)代栽培品種都含有它們的血緣。本研究單獨將黑車?yán)锉?、拔地拉、崖城割手密、印度割手密及云南割手密種質(zhì)同NG77/001（大莖野生種）和育巴（中國種）一起進(jìn)行了RAPD分析，從S418、S427及S1367引物的RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物中回收了甘蔗親本種的特異條帶42條。各份種質(zhì)的回收帶所占比例各不相同，其中割手密種特異的21條，熱帶種特異9條，野生種特異2條，親本種多態(tài)性條帶10條。在所回收的特異條帶中，以割手密占的比例最多（占50%），這說明，割手密種的條帶多態(tài)性高于甘蔗屬中的其它種，表明割手密種與其它種間存在較大的遺傳差異。其中引物S418及S1367引物對36份甘蔗親本種及6份親本種的混合基因組DNA進(jìn)行RAPD擴(kuò)增的結(jié)果分別見圖1和圖2。從圖1可見，用S418引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增時有一條分子量大小約為970～985bp的片段（如a）為甘蔗屬特異帶；在分子量大小約為433bp（如b）處有一代表割手密種的特異帶，該帶在其它親本種中均未擴(kuò)增出，命名為Rsp2；在分子量大小約為560～580bp（如c）處，印度割手密能擴(kuò)增出一條清晰而區(qū)別于其它種質(zhì)的印度割手密種特有帶，命名為Rsp5；在分子量大小約為700bp（如d）處，大部分云南割手密種質(zhì)有的一條清晰的區(qū)別于其它種質(zhì)的特有帶，命名為Rsp6；在分子量大小約為1420bp（如e）處，印度割手密有一條清晰的區(qū)別于其它種質(zhì)的特有帶；而在所有割手密種上都基本共存一條分子量大小約為1612bp（如f）的種特異帶。從圖2可見，用S1367引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增時，能在熱帶種和大莖野生種中擴(kuò)增出一條大小約為970～985bp（如a）的片段，而在割手密種、中國種、印度種等種質(zhì)中無此擴(kuò)增片段，命名為RSo13；同時能在割手密種、中國種、印度種擴(kuò)增出一條大小約為590～596bp（如b）的片段，而熱帶種和大莖野生種則在此處無擴(kuò)增片段，命名為RSp16。2.2克隆片段pucm-t和pcr檢測從S418及S1367的RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物中回收RSp2、RSp5、RSp6、RSo13及RSp165個RAPD標(biāo)記特異片段，分別克隆于pUCm-T載體（上海生工產(chǎn)）中?？寺∑蔚臋z測采用PCR檢測法（用各標(biāo)記分析中的選擇性擴(kuò)增引物檢測）。經(jīng)測序后，采用NCBI網(wǎng)站提供的BLAST2sequences軟件工具分析，獲得這5個片段的全長序列，并且RSp2片段長度為439bp,RSp5片段長度為566bp,RSp6片段長度為678bp,RSo13片段長度為971bp,RSp16片段長度為706bp。2.3甘蔗母種的rapd標(biāo)記轉(zhuǎn)換為scar標(biāo)記的建立2.3.1scar引物篩選用Primer3在線引物設(shè)計軟件，在RSp2、RSp5、RSp6、RSo13及RSp16的全序列片段兩端適當(dāng)位置設(shè)計合成了SCAR引物共15對（表2）。其中RSp2的特異SCAR引物4對（表2,ZT51～ZT53、ZT55）,RSp5的特異SCAR引物4對（表2,ZT56～ZT59）,RSp6的特異SCAR引物2對（表2,ZT60～ZT61）,RSo13的特異SCAR引物3對（表2,ZT40～ZT42）及RSp16的特異SCAR引物2對（表2,ZT43～ZT44）。對合成的SCAR引物以12份親本種基因組為模板進(jìn)行SCAR引物特異性篩選。結(jié)果見表3及圖3。從表3及圖3中可知，在由甘蔗親本種特異RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記設(shè)計的15對引物中，2對為甘蔗屬特異引物，2對無擴(kuò)增條帶，6對為多態(tài)性引物，5對為割手密種特異引物，在特異引物篩選時均獲得預(yù)期的結(jié)果，即在ZT51、ZT52、ZT53及ZT55對10個甘蔗親本種模板DNA特異擴(kuò)增時，只在割手密種中有唯一的439bp條帶，而在其它8份親本種中未見有擴(kuò)增條帶。這表明RSp2這一甘蔗割手密種特異的RAPD標(biāo)記已成功轉(zhuǎn)化成甘蔗割手密種特異SCAR標(biāo)記。2.3.2甘蔗栽培品種的分子檢測用甘蔗割手密種特異的RAPD標(biāo)記RSp2成功轉(zhuǎn)化的甘蔗割手密種特異SCAR引物ZT51和ZT52分別對96份甘蔗種質(zhì)（表1）進(jìn)行了SCAR檢測。檢測結(jié)果見圖4。從圖4可見，RSp2這一甘蔗割手密種特異的RAPD標(biāo)記已成功轉(zhuǎn)化成甘蔗割手密種特異SCAR標(biāo)記。ZT51與ZT52均為RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化的割手密種特異引物，是根據(jù)割手密種特異的RAPD標(biāo)記片段Rsp2(439bp）的測序結(jié)果設(shè)計的2對特異引物，能在崖城割手密、印度割手密及部分云南割手密親本種中特異檢測出特異標(biāo)記。用ZT51引物對39份甘蔗親本種和57份甘蔗栽培種進(jìn)行特異PCR檢測，該引物能在崖城割手密、印度割手密、華南割手密及大部分云南割手密親本種中特異檢測出，并在47份甘蔗栽培種上檢測出特異標(biāo)記條帶，一個長度為439bp的割手密種特異DNA序列（圖4,A）。通過對這47份種質(zhì)系譜的追溯，發(fā)現(xiàn)為含有割手密血緣的2～4物種血緣的甘蔗栽培品種（品系），其中包括閩糖70-611，故該長度為439bp的割手密種特異DNA序列，可作為有效鑒定現(xiàn)代甘蔗栽培品種（品系）是否含有割手密血緣的特異標(biāo)記片段，記為ZT51-439，為顯性標(biāo)記。用ZT52引物對57份甘蔗栽培種進(jìn)行特異PCR檢測，只能在1份甘蔗栽培種（閩糖70-611，第76號）上檢測出1條長度為439bp的特異標(biāo)記條帶，命名為ZT52-439（圖4,B）。從系譜圖可知閩糖70-611是由CP49-50與F134的F1代，而CP49-50是由CP34-120與Co356雜交而育成，F(xiàn)134是由Co290與POJ2878雜交而育成的，閩糖70-611是含有熱帶種、印度種及割手密種三血緣的栽培種，故甘蔗割手密種特異SCAR標(biāo)記檢測結(jié)果從分子水平證明了這一點。應(yīng)用由RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化的割手密種特異DNA序列ZT52-439，可有效地將閩糖70-611與其它的栽培品種（品系）區(qū)別、鑒定出來，并且均為顯性標(biāo)記。3rapd標(biāo)記pcr和scar引物篩選甘蔗祖親種特異DNA序列的研究，目前，國內(nèi)外學(xué)者用其它方法也只從甘蔗屬及其近緣屬中找到屬的特異DNA序列。BesseandMcIntyre(1998）分離出4個對蔗茅屬具有特異性的DNA重復(fù)序列，以此為蔗茅屬的特異探針進(jìn)行Southern雜交，可以用于鑒定該屬的種質(zhì)，及檢測蔗茅屬與甘蔗屬的雜種基因組構(gòu)成。Alixetal.（1998）從蔗茅屬的基因組DNA分離出了一個長371bp的蔗茅屬特異衛(wèi)星DNA序列。Alixetal.（1999）用Alu-PCR法在甘蔗屬及其近緣的蔗茅屬和芒屬（Miscanthus）中擴(kuò)增并分離出屬特異的似Alu片段，用其作探針或轉(zhuǎn)化為特異PCR引物對時，均能鑒定出各自的屬。莊南生等（2004）在進(jìn)行甘蔗種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)的AFLP分析與種屬特異探針的研究中，篩選出了5個甘蔗屬特異探針及2個斑茅特異探針，這些特異探針可用于斑茅與甘蔗屬的雜種鑒定。Selvietal.（2003）應(yīng)用玉米SSR標(biāo)記對甘蔗遺傳多樣性進(jìn)行研究時，獲得了能區(qū)別甘蔗屬與蔗茅屬的屬特異DNA片段及一個長度為380bp的印度種的特有片段。曾華宗等（2003）采用RAPD技術(shù)分析甘蔗種質(zhì)間的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)某些甘蔗親本種質(zhì)具有特異RAPD標(biāo)記帶3個，但尚未進(jìn)行特異PCR研究。本研究在甘蔗種質(zhì)中利用甘蔗祖親種RAPD標(biāo)記的SCAR轉(zhuǎn)化分析技術(shù)，獲得了5個甘蔗親本種RAPD標(biāo)記特異片段，根據(jù)這5個RAPD標(biāo)記特異片段測序結(jié)果設(shè)計的15對SCAR標(biāo)記引物經(jīng)特異引物篩選，篩選了一批甘蔗屬特異及甘蔗割手密種特異的SCAR引物。這些割手密種特異的SCAR引物在鑒定含割手密種血緣雜交種上已證明是有效的。本研究尚有部分特異序列未能成功轉(zhuǎn)化成特異SCAR，如從RAPD標(biāo)記中回收的RSo13片段，原為熱帶種和大莖野生種兩物種特異片段，經(jīng)SCAR轉(zhuǎn)化后卻表現(xiàn)為甘蔗屬特異或多態(tài)性；原為云南割手密種特異片段RSp6，經(jīng)SCAR轉(zhuǎn)化后也表現(xiàn)為多態(tài)性。這與夏得安等（2008）進(jìn)行與白樺纖維長度顯著相關(guān)的特異ISSR標(biāo)記向SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化時，發(fā)現(xiàn)其SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化率低是一致的。這可能是由于轉(zhuǎn)化成SCAR時，引物退火溫度尚未達(dá)到最佳的結(jié)果。近年來，已有很多RAPD標(biāo)記成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記的例子（ParanandM