利用差示掃描量熱法研究接枝原花青素與蛋白酶的相互作用

利用差示掃描量熱法研究接枝原花青素與蛋白酶的相互作用

酒精的生產(chǎn)、質(zhì)量和口感與微生物的生命活動(dòng)以及微生物代謝產(chǎn)生的酶密切相關(guān)。α-淀粉酶和蛋白酶是影響白酒產(chǎn)量和質(zhì)量的2種重要的酶,通過前期GC-MS的分析研究表明,SPC對(duì)小曲酒的揮發(fā)性成分產(chǎn)生了明顯的影響。自從美國(guó)Waston和O’Neill提出差示掃描量熱(DSC)的概念以來,DSC在研究蛋白質(zhì)和酶構(gòu)象變化的動(dòng)力學(xué)方面得到廣泛應(yīng)用。楊小民和楊基礎(chǔ)認(rèn)為,海藻糖與纖維素酶分子間以氫鍵的形式結(jié)合后,表現(xiàn)在酶的熱變性溫度和熱焓皆發(fā)生變化。由于原花青素具有抑菌特性和酶活力調(diào)節(jié)特性,本研究旨在通過分析SPC與α-淀粉酶和蛋白酶混合物的DSC熱譜圖,探討它們之間的相互作用機(jī)制,為研究SPC對(duì)2種酶活力的調(diào)節(jié)作用提供依據(jù)。1材料和方法1.1材料、試劑和機(jī)器1.1.1實(shí)驗(yàn)材料高粱原花青素:按照劉睿等方法制備,含量大于95%,主要是由聚合度小于6的低聚體組成。1.1.2主試劑α-淀粉酶:Sigma公司,酶活:870u/mg。蛋白酶:丹麥諾和諾德公司(北京)分公司,酶活2.4AU/g。1.1.3主要設(shè)備DSC儀:DSC-Q10型(美國(guó)TA公司)。1.2樣品制備和測(cè)定方法分別取一定量不同濃度的SPC溶液(對(duì)照用蒸餾水)與不同的酶(α-淀粉酶和蛋白酶)作用30min后,取50μL待測(cè)樣品放入鋁質(zhì)樣品盤中,參比為空白鋁樣品盤,加蓋壓緊后置于測(cè)量池中,于40mL/min氮?dú)饬髁肯逻M(jìn)行測(cè)量,實(shí)驗(yàn)所用升溫速率為10℃/min,測(cè)量范圍為40~250℃。2結(jié)果與分析2.1spc與-淀粉酶的熱變圖1為SPC溶液典型的DSC曲線。可以看出,其熱變性溫度(Td)為132.66℃,即為SPC發(fā)生相轉(zhuǎn)變的溫度,作切線后可以得到其發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變的溫度為117.32℃,其熱焓變?yōu)?.119kJ/g。圖2所示為m(α-淀粉酶)∶m(H2O)=1∶1的DSC曲線。其熱變性溫度Td為195.5℃,其熱焓變?yōu)?.65kJ/g,玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為184.03℃。濃度為0.25mg/mL的SPC與α-淀粉酶按1∶1的質(zhì)量比混合作用30min后的DSC曲線如圖3所示。相對(duì)于SPC溶液和m(α-淀粉酶)∶m(H2O)=1∶1的DSC曲線皆為單一放熱峰而言,添加0.25mg/mL的SPC后其DSC曲線發(fā)生了顯著的變化,在曲線中并沒有顯示SPC和α-淀粉酶的熱焓變特征曲線,而是在133.70℃和189.85℃分別出現(xiàn)1個(gè)小的和1個(gè)大的2個(gè)放熱峰,Td為133.7℃時(shí)的熱焓變?yōu)?.174kJ/g,Td為189.65℃時(shí)的熱焓變?yōu)?.208kJ/g,提示SPC與α-淀粉酶分之間發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用,致使DSC曲線發(fā)生變化。兩者的結(jié)合導(dǎo)致α-淀粉酶的熱相變溫度降低,熱焓變降低,使α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性降低,從而影響α-淀粉酶的活力。圖4為0.50mg/mLSPC與α-淀粉酶按1∶1質(zhì)量比混合作用30min后的DSC熱譜圖。從圖3可以看出,隨著SPC濃度的增加,α-淀粉酶的熱相變溫度降低得愈多(為176.52℃),其熱焓變也低于未作用的α-淀粉酶,為1.473kJ/g;另一個(gè)小的放熱峰的熱相變溫度和熱焓變也隨之降低,分別為125.8℃和0.05519kJ/g?？梢婋S著SPC濃度的增大,SPC與α-淀粉酶的作用力增強(qiáng),導(dǎo)致α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性下降,從而使酶活力降低。但是熱焓變卻隨著SPC濃度增大而略有增加,但仍然低于單純的α-淀粉酶,其原因尚待進(jìn)一步研究。濃度為1.00mg/mL的SPC與α-淀粉酶按1∶1質(zhì)量比混合作用30min后的DSC曲線見圖5。此時(shí)α-淀粉酶的變性溫度不但沒有進(jìn)一步降低,反而升高到193.75℃,其熱焓變?yōu)?.353kJ/g,同樣低于α-淀粉酶與水混合的熱焓變。產(chǎn)生這種Td隨抑制劑SPC濃度增加反而升高的現(xiàn)象可能與酶的空間構(gòu)象和結(jié)構(gòu)域變化相關(guān)。曾利榮等在研究H2O2對(duì)超氧化物歧化酶的抑制作用時(shí),也發(fā)現(xiàn)類似的情況。2.2spc與蛋白酶作用的dsc分析圖6為m(蛋白酶)∶m(H2O)=1∶1的DSC曲線,其熱變性溫度Td為186.31℃,對(duì)應(yīng)的熱焓變?yōu)?.7907kJ/g。SPC(0.25mg/mL)與蛋白酶相互作用后DSC曲線如圖7所示,蛋白酶的熱變性溫度降低,而且只有一個(gè)單一的放熱峰出現(xiàn),說明在此濃度下SPC與蛋白酶發(fā)生結(jié)合。圖8所示為SPC(0.5mg/mL)與蛋白酶作用的DSC曲線,SPC(0.5mg/mL)與蛋白酶混合后導(dǎo)致其熱相變溫度和熱焓發(fā)生變化,提示兩者發(fā)生相互作用。圖9為SPC(1.0mg/mL)與蛋白酶作用的曲線。從DSC曲線變化和蛋白酶相變溫度和熱焓的變化可以看出,隨著SPC濃度的增加,兩者的相互作用增強(qiáng),且比SPC與β-淀粉酶的作用顯著(另文發(fā)表)。3spc酶作酶采用DSC的方法研究SPC與α-淀粉酶和蛋白酶作用的熱特性,在實(shí)驗(yàn)濃度下(0.25、0.5、1.0mg/mL),SPC分別與α-淀粉酶和蛋白酶結(jié)合后,可能通過氫鍵和疏水相互作