三仁湯及拆方對大鼠高脂血癥模型血脂及代謝產(chǎn)物譜的影響

三仁湯及拆方對大鼠高脂血癥模型血脂及代謝產(chǎn)物譜的影響

據(jù)研究，脂代謝紊亂不僅是主要的人類疾病因素，如動脈硬化、冠狀動脈粥樣硬化、腦卒中、糖尿病并發(fā)癥和代謝綜合征，以及其他身體系統(tǒng)的重要疾病。它是人類疾病的最大威脅。中醫(yī)藥作為治療高脂血癥的途徑之一,對高脂血癥的防治具有獨特的作用和優(yōu)勢。因此,根據(jù)我國國情,充分發(fā)揮中西醫(yī)結(jié)合的優(yōu)勢,采取綜合措施,降低其導致動脈粥樣硬化的危險性是我國心血管疾病研究的一個重要方面。本研究采用高脂飼料喂飼法復(fù)制大鼠高脂血癥模型,選擇調(diào)暢三焦氣機的經(jīng)典代表方劑三仁湯,并根據(jù)其組方原理、配伍及功效,將該方拆為上焦方、中焦方和下焦方,采用核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)和生化分析技術(shù),觀察在三仁湯全方及不同拆方干預(yù)下高脂血癥模型大鼠血脂和代謝產(chǎn)物譜的變化情況。材料和方法1實驗動物,4.9.做好研究,5.9.32%g健康雄性SD大鼠70只,SPF級,體重(196.25±9.92)g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。許可證編號:SCXK(京)2007-0001。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度22～25℃,濕度70%,自由飲水。2中藥飲片制備三仁湯(由苦杏仁15g、滑石18g、通草6g、竹葉6g、厚樸6g、生薏苡仁18g、半夏10g、白蔻仁6g組成),上焦方(苦杏仁15g),中焦方(由白蔻仁6g、半夏10g、厚樸6g組成),下焦方(由生薏苡仁18g、滑石18g、通草6g、竹葉6g組成),各味中藥飲片由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供。北京市中醫(yī)研究所藥化室制備水提取物浸膏,4℃保存?zhèn)溆谩ｊ栃詫φ账帪榘⑼蟹ニ♀}(立普妥,20mg/片,輝瑞制藥有限公司,批號:85837024)。3-三甲基硅烷基重水(D2O)、氘代氯仿及氘代甲醇,均為美國CambridgeIsotopeLaboratories,Inc.公司;3-三甲基硅烷基-2,2,3,3-四氘代丙酸鈉(TSP),德國Merck公司。肝素鈉,購自上海生物化學試劑商店;血脂試劑盒購自北京北化泰康臨床試劑有限公司。試劑批號:甘油三酯(TG):20090301;總膽固醇(TC):20090309;高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C):20090321;低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C):20090125。4脈沖場梯度ftnmr美國瓦里安公司(Varian,Inc.)INOVA600MHz超導核磁共振譜(superconductingfouriertransformnuclearmagneticresonance,FTNMR)儀,配備脈沖場梯度,帶梯度場的三共振探頭;離心機:德國Eppendorf公司MiniSpinPlus個人微型高速離心機。ZS-3型半自動生化分析儀,北京中生公司。5高脂飼料的配制實驗動物普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后,采用隨機數(shù)字表法隨機分為正常對照組(正常組)、模型組、三仁湯組、上焦方組、中焦方組、下焦方組及阿托伐他汀鈣組(對照組),每組10只。正常組給予基礎(chǔ)飼料;其余各組給予高脂飼料。飼料以每只30g/d投放,實驗期間自由飲水。高脂飼料參照文獻所述方法配制:膽固醇4%,豬油10%,丙基硫氧嘧啶0.2%,膽酸鈉0.3%,基礎(chǔ)飼料85.5%。由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所工作人員混勻后,壓制成高脂飼料,進行飼喂。于造模開始時按成人等效劑量分別給4組(三仁湯組、上焦方組、中焦方組、下焦方組)大鼠灌胃;對照組給予阿托伐他汀鈣(4.8mg/kg);正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。每天給藥1次。6血液收集與制備于造模后第3周取血,進行血脂及代謝組學檢測及分析。用10%水合氯醛(0.3mL/kg體重)腹腔麻醉大鼠后,經(jīng)腹主動脈收集血液,一部分加入肝素鈉抗凝管中,制備血漿用于代謝組學分析。采集的血漿于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。剩余部分離心(3500r/min,20min),制備血清,用于檢測血脂4項:TC、TG、LDL-C以及HDL-C。7血液測試采用生化分析儀檢測TC、TG、LDL-C及HDL-C。8代謝組的檢測與分析8.1酸鈉[2,2,3,3,3,3,3,3-o-trimethylusamesims,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3-trimethylus的合成向編號后的EP管中分別依次加入100μL(3-三甲基硅烷基)-2,2,3,3-四氘代丙酸鈉[2,2,3,3-D(4)-3-(trimethylsilyl)propionicacidsodiumsalt,TSP]的重水溶液(1mg/mL),200μL血漿以及300μL重水,充分震蕩混勻后,13000r/min離心10min。8.2低表面活性劑代謝產(chǎn)物的提取對血漿樣本進行核磁共振氫譜(1Hnuclearmagneticresonancespectrum,1HNMR)測定,包括弛豫編輯實驗(CPMG脈沖序列)和擴散編輯實驗(LED脈沖序列),分別觀測血漿中的小分子代謝物和脂類代謝產(chǎn)物。所有實驗的譜寬為8000Hz,采樣點為32k,弛豫延遲為2s,采樣時間為4s,累加次數(shù)為64次。CPMG實驗的自旋回波時間(2n)為320ms,LED實驗的擴散時間為100ms,梯度場強度為35G/m。8.3cpgm分段積分對所得NMR數(shù)據(jù)經(jīng)傅立葉變換得到譜圖,經(jīng)相位校正和基線校正之后,對CPMG數(shù)據(jù)將范圍為0.4-4.4區(qū)間內(nèi)的譜圖按每段0.01ppm的寬度進行分段積分,其中;對LED數(shù)據(jù)將范圍為0.1-6.0的數(shù)據(jù)按每段0.04ppm的寬度進行分段積分,并將4.62-5.1段排除。8.4eden分析將所有積分數(shù)據(jù)輸出到Excel文件保存,然后輸入到SIMCA-P+軟件(v10.04,Umetrics,Ume?,Sweden)進行分析。數(shù)據(jù)采用Pareto標度化(Paretoscaling)進行預(yù)處理之后采用主成分分析(principlecomponentanalysis,PCA)分析。為擴大組間差異,消除無關(guān)因素影響,進一步采用偏最小二乘判別分析(partialleastsquare-discriminantanalysis,PLS-DA)。結(jié)果以得分圖和載荷圖表示。9統(tǒng)計學分析血脂4項數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)以ˉx±sxˉ±s表示,所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗,符合正態(tài)或近似正態(tài)性分布。組間比較采用單因素方差分析LSD檢驗。大鼠血漿pls-da分析1各組大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C比較(表1)與正常組比較,模型組TC、LDL-C升高(P<0.05)。與模型組比較,各用藥組TC、LDL-C均降低(P<0.01,P<0.05)。與三仁湯組比較,上焦方組TC升高(P<0.05),上焦方組其余指標及其他各用藥組各指標比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。2正常組與模型組大鼠血漿1HNMR比較(圖1)從弛豫編輯譜(CPMG)PLS-DA分析得分圖中可以看出,正常組與模型組能很好地分開。與正常組比較,模型組中葡萄糖(3.2-3.9)和谷氨酰胺(2.45)增加,而纈氨酸(1.04,0.98),亮氨酸/異亮氨酸(0.93-1.01),乳酸(1.32),丙氨酸(1.48),乙酸(1.91),乙酰乙酸(2.23),肌酸(3.03),膽堿(3.21)等含量減少。從擴散編輯譜的PLS-DA分析結(jié)果得分圖中可以看出,正常組與模型組能夠在第二組成分方向明顯分開。與對照組相比,模型組的血脂總體升高(0.91,1.3),但多不飽和脂肪酸(2.79,5.3)含量下降。3模型組與各治療組大鼠血漿1HNMR比較(圖2)CPMG:各組之間存在差別,其中三仁湯組、中焦方組、下焦方組與模型組差別最大,而對照組與模型組差別最小。上焦方組顯示較特別的差異,其葡萄糖(3.00-4.00)含量較其他組高。由此可以看出,三仁湯組對模型的作用要明顯高于對照組和上焦方組,與中焦方組和下焦方組區(qū)別較小。與模型組比較,各治療組乳酸(1.33)略有增加,丙氨酸(1.48),丙酮酸(2.38),甜菜堿(3.42)也有增加。LED:與模型組比較,各治療組血脂含量(0.87,1.26,1.3)均降低,上焦組和下焦組與對照組近似。與其他組比較,三仁湯組N-乙酰糖蛋白(2.06)和O-乙酰糖蛋白(2.15)的含量升高。仁湯治療高血壓的臨床研究以高脂血癥、糖尿病、代謝性高血壓等為代表的代謝障礙綜合征屬于慢性、全身性、代謝性疾病,對全身多個臟器均造成持久、廣泛的傷害,其病理機制似非某單一臟腑所能概括。而中醫(yī)三焦氣化理論則涵蓋了整體的代謝功能,因此認為脂代謝紊亂在中醫(yī)當屬于三焦病范疇。三焦功能活動所涉及的范圍相當廣泛,它是在其他五臟、五腑功能相互作用的基礎(chǔ)上派生出來的新的功能項。有學者提出,三焦學說與脂肪組織及其內(nèi)分泌功能極相似,參與調(diào)節(jié)糖、脂、能量的代謝。三焦功能失調(diào)是代謝綜合征的發(fā)病基礎(chǔ),調(diào)理三焦法是治療代謝綜合征的主要法則,在代謝綜合征、糖尿病的治療方面做了有益探索。脂質(zhì)代謝紊亂多由于過食肥甘,超出了三焦的運化能力,或三焦敷布轉(zhuǎn)輸失調(diào),致使水谷精微不能歸于正途被機體利用,反堆積體內(nèi),釀成痰濁,并且充斥三焦,阻塞“管道”,凝滯氣血,危害周身。因此,三焦氣化失司是三焦病的主要病機。三仁湯源于吳塘《溫病條辨》。除急性傳染性、感染性疾病如腸傷寒、病毒性肝炎等此類傳統(tǒng)意義上的“濕溫時病”外,臨床各科多種疾病但凡經(jīng)辨證在病因病機上屬于濕邪為患者,皆可以本方隨癥加減。方中杏仁宣開上焦肺氣,白蔻仁芳燥中焦脾胃,薏苡仁滲利下焦腎與膀胱,“三仁”各顧三焦。張春光等采用三仁湯加減方治療脂肪肝伴有血糖異?；颊?4例,患者甘油三酯及血糖均明顯下降,療效優(yōu)于對照組。周燕萍等研究結(jié)果表明以三仁湯為基礎(chǔ)方的宣氣化濕法具有很好的調(diào)脂作用。陳晶等結(jié)果顯示三仁湯加減方可顯著降低空腹血糖、甘油三脂水平,提高高密度脂蛋白水平。本研究基于三焦氣化理論和三仁湯的組方原理、配伍及功效,將該方拆為上焦方、中焦方和下焦方,探討三仁湯全方及不同拆方對高脂血癥大鼠代謝產(chǎn)物譜的影響和對高脂血癥大鼠血脂的作用。研究結(jié)果顯示三仁湯全方及不同拆方均有不同程度的降脂作用,且三仁湯全方的降脂優(yōu)于各拆方。表明通過合理組方,從整體調(diào)暢三焦氣化功能則改善血脂水平的作用優(yōu)于單一對上焦、中焦和下焦氣化功能的調(diào)節(jié)。同時,本研究觀察了三仁湯全方及上焦方、中焦方和下焦方拆方對高脂血癥模型大鼠血漿代謝產(chǎn)物譜的作用。采集血漿的1HNMR譜,并用模式識別方法進行代謝組學分析。從1HNMR圖譜及模式識別分析發(fā)現(xiàn):(1)與正常組比較,高脂血癥模型大鼠血漿中血脂含量、葡萄糖和谷氨酰胺增加,而纈氨酸、亮氨酸/異亮氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸、乙酰乙酸、肌酸、膽堿,以及不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量降低。這表明大鼠高脂血癥模型存在明顯的糖脂代謝及能量代謝紊亂。(2)三仁湯組對模型的作用要明顯高于對照組和上焦方組;并且三仁湯組、中焦方組、下焦方組之間也存在一定差異。上焦方和下焦方組與阿托伐他汀鈣的作用近似。谷氨酰胺是體內(nèi)氮的運載體,對維護機體正常的蛋白代謝起重要作用,可促進機體蛋白合成,降低蛋白分解;膽堿是一種維生素類化合物,它對細胞膜完整性及脂類消化運輸發(fā)揮重要作用;谷氨酰胺、不飽和脂肪酸、VLDL/LDL、膽堿是維持細胞正常結(jié)構(gòu)的基本物質(zhì);谷氨酰胺、不飽和脂肪酸、N-乙酰糖蛋白、O-乙酰糖蛋白是維持機體正常免疫功能的基本物質(zhì);N-乙酰糖蛋白、O-乙酰糖蛋白、不飽和脂肪酸與血液流變學和凝血功能相關(guān)。乳酸是體內(nèi)三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物;肌酸是尿中主要非蛋白氮代謝產(chǎn)物之一,其含量與腎功能正常與否關(guān)系密切,可作為腎病的標志物之一。這些物質(zhì)的變化反映了大鼠高脂血癥模型出現(xiàn)了糖脂代謝紊亂、免疫功能減弱、凝血功能障礙等一系列的病理機