實(shí)驗(yàn)二-高效液相色譜法分析飲料中咖啡因的含量

PAGEPAGE1高效液相色譜法分析飲料中咖啡因的含量院（系）生化系年級2009級專業(yè)制藥工程姓名吳雄輝學(xué)號0940902007課程名稱基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)日期2011年12月日實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)3L5樓指導(dǎo)教師夏湘黃玉一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）熟悉高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)，理解反相HPLC的原理和應(yīng)用；（2）掌握外標(biāo)定量法。二．實(shí)驗(yàn)原理咖啡因又稱咖啡堿，屬黃嘌呤衍生物，化學(xué)名稱為1，3，7-三甲基黃嘌呤，是從茶葉或咖啡中提取的一種生物堿。它能興奮大腦皮層，使人精神亢奮?？Х纫蛟诳Х戎械暮考s為1.2%-1.8%，在茶葉中約為2.0-4.7%?？蓸凤嬃?、止痛藥等均含咖啡因?？Х纫虻姆肿邮綖镃8H10O2N4，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下圖：在化學(xué)鍵合相色譜法中，若采用的流動相的極性大于固定相的極性，則稱為反相化學(xué)鍵合相色譜法。該方法是目前應(yīng)用最為廣泛的色譜方法。本實(shí)驗(yàn)采用C18鍵合相色譜柱分離飲料中的咖啡因，用紫外檢測器進(jìn)行檢測，以咖啡因標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的色譜峰面積對其濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)試樣中咖啡因的峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出試樣中咖啡因的濃度。三．實(shí)驗(yàn)用品儀器：高效液相色譜儀、恒流泵、超聲波清洗儀、紫外光檢測器等。試劑：甲醇（分析純）、咖啡因（分析純）、二次蒸餾水咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：（1）標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制含咖啡因1000ug/mL的甲醇溶液，備用。（2）標(biāo)準(zhǔn)系列溶液用上述備用液配制含咖啡因20ug/mL、40ug/mL、80ug/mL、160ug/mL、320ug/mL的甲醇溶液，備用。試樣市售的可口可樂和百事可樂。四．實(shí)驗(yàn)條件（1）色譜柱長150mm，內(nèi)徑4.6mm，裝填C-18烷基鍵合物，顆粒度10μm的固定相（2）流動相甲醇-水（60：40），流量0.6m/mim（3）紫外光度檢測器測定波長254mm，靈敏度0.08（4）進(jìn)樣量10μL五．實(shí)驗(yàn)步驟（1）將配制好的流動相置于超聲波清洗儀上脫氣15min；（2）根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，將儀器按照儀器的操作步驟調(diào)節(jié)至進(jìn)樣狀態(tài)，待儀器液路和電路系統(tǒng)達(dá)到平衡時(shí)，色譜工作六站或記錄儀的基線呈平直，即可進(jìn)樣；（3）依次分別吸取10μL的可樂試樣進(jìn)樣，并記錄各色譜儀的數(shù)據(jù)；（4）分別將約20mL的可口可樂和百事可樂試樣置于25mL的容量瓶中，用超聲波清洗儀脫氣15min；（5）依次分別吸取10μL的可樂試樣進(jìn)樣，記錄各色譜儀的數(shù)據(jù)；（6）試驗(yàn)結(jié)束后，按要求關(guān)好儀器。六．實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理（1）記錄實(shí)驗(yàn)條件（2）處理色譜數(shù)據(jù)，將系列對照品溶液與可樂試樣的咖啡因色譜峰保留時(shí)間及峰面積列于下表中：序號標(biāo)樣濃度μg·mL-1保留時(shí)間tR色譜峰面積S色譜峰高度H1205.037706020416742405.0371297842711673805.08617375109627241605.071207378211062353205.1201646966943306可口可樂5.09821481241179647百事可樂5.18543157125125（3）繪制咖啡因色譜峰面積-對照品溶液濃度的回歸曲線，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。將標(biāo)樣的數(shù)據(jù)利用EXCEL軟件繪圖，并計(jì)算回歸方程，如下：（4）根據(jù)可樂試樣中咖啡因色譜峰面積值，計(jì)算可樂試樣中的咖啡因濃度。標(biāo)樣色譜峰面積S濃度μg·mL-1茶葉164696658.5039百事可樂214812480.56676速溶咖啡4315714.997623七．思考題（1）用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量有什么優(yōu)缺點(diǎn)？答：標(biāo)準(zhǔn)曲線法的優(yōu)點(diǎn)是：繪制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線后測定工作就變得相當(dāng)簡單，可直接從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上讀出含量，因此特別適合于大量樣品的分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線法的缺點(diǎn)是：每次樣品分析的色譜條件（檢測器的響應(yīng)性能，柱溫，流動相流速及組成，進(jìn)樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差。此外，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制時(shí)，一般使用欲測組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品（或已知準(zhǔn)確含量的樣品），而實(shí)際樣品的組成卻千差萬別，因此必將給測量帶來一定的誤差。（2）根據(jù)咖啡因