hbvdnac啟動(dòng)子三鏈結(jié)構(gòu)的高并聯(lián)寡核苷酸鏈的合成與鑒定

hbvdnac啟動(dòng)子三鏈結(jié)構(gòu)的高并聯(lián)寡核苷酸鏈的合成與鑒定

一些準(zhǔn)分酸不僅可以通過(guò)與互補(bǔ)鏈核的結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)，還可以通過(guò)與雙鏈核中含有豐富酪氨酸酸（同構(gòu)酪氨酸酸）的區(qū)域，特征法將其結(jié)合成三鏈結(jié)構(gòu)。這種能形成三鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(Triplehelix-formingoligonucleotide,TFO)通過(guò)Hoogsteen或逆Hoogsteen氫鍵與雙鏈靶DNA同聚嘌呤區(qū)相互作用,纏繞于DNA的深溝內(nèi),并可阻止靶DNA與核酸聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子等蛋白結(jié)合,抑制靶基因復(fù)制和表達(dá)。TFO使人工調(diào)控特定基因表達(dá)成為可能,為難治性DNA病毒感染的治療展示了一個(gè)新的方向。鑒于目前尚無(wú)根治乙型肝炎病毒感染的理想藥物,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)多種理論上有可能與HBV-DNAC啟動(dòng)子區(qū)序列形成三鏈結(jié)構(gòu)的TFO,觀察其與HBV-DNAC啟動(dòng)子區(qū)序列結(jié)合的親和性、特異性、篩選最佳TFO,為進(jìn)一步的HBV基因轉(zhuǎn)錄抑制實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ),探索治療HBV感染的新方法。1材料和方法1.1準(zhǔn)分酸的合成在GibcoBRL公司以亞磷酰胺三脂固相法合成圖1所示的脫氧寡核苷酸,經(jīng)C-18反相柱、聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。1.2寡核苷酸的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)分別取兩對(duì)上述合成的互補(bǔ)寡核苷酸(Target1和Target2)的正鏈和副鏈各500pmol,混合,加5mol/LNaCl4μl、無(wú)菌超純水84μl,75°C水浴12min,逐漸冷至25°C,使互補(bǔ)的寡核苷酸雜交成雙鏈靶DNA,用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)證實(shí)雜交完全。然后以3′末端填充法標(biāo)記靶DNA:取靶DNA40pmol,加20μCi[α-32P]dCTP(～3000Ci/mmol),10mmol/LdATP、dGTP、dTTP各1μl,大腸桿菌DNA聚合酶Iklenow片段10U,補(bǔ)充無(wú)菌超純水使反應(yīng)總體積達(dá)20μl,30°C溫育30min,加0.5mol/LEDTA1μl終止反應(yīng),然后以SephadexG-50柱層析純化標(biāo)記的靶DNA片段,并以熒光分光光度法測(cè)標(biāo)記靶DNA濃度,用FH液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)其放射活性,估算靶DNA放射比活性。1.3ris-hcl32P標(biāo)記靶DNA片段1pmol(1300cpm)與不同終濃度的各種TFO混合于三鏈DNA結(jié)合緩沖液(20mmol/LTris-HClpH7.4,10mmol/LMgCl2,10%蔗糖)中,反應(yīng)總體積10μl,37°C水浴過(guò)夜。結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)樣于15%聚丙酰胺凝膠(丙烯酰胺∶亞甲雙丙烯酰胺=19∶1)上,用TEM10電泳緩沖液(89mmol/LTris-硼酸pH8,10mmol/LMgCl2),在4°C環(huán)境中電泳(9V/cm)過(guò)夜。然后進(jìn)行凝膠放射自顯影,并用薄層掃描儀測(cè)X線顯影帶的光密度。1.4反應(yīng)平衡過(guò)程中tfo濃度的計(jì)算參照文獻(xiàn),按下列公式計(jì)算三鏈DNA解離常數(shù)(Kd):Kd=[duplex][TFO][triplex]Κd=[duplex][ΤFΟ][triplex]式中triplex為三鏈DNA,duplex為雙鏈DNA,表示終濃度,當(dāng)寡核苷酸與靶序列結(jié)合,反應(yīng)體系中[triplex]=[duplex]時(shí)(即薄層掃描顯示X線片中三鏈DNA與雙鏈DNA條帶的光密度值相等),Kd=[TFO],由于反應(yīng)體系中[TFO]>>[triplex],反應(yīng)平衡后的TFO的終濃度的近似于其反應(yīng)初濃度,故Kd值約等于反應(yīng)體系中所加入的TFO濃度。參照Olivas的方法,以本實(shí)驗(yàn)體系最好的TFO為參考基準(zhǔn),計(jì)算各TFO與靶序列結(jié)合的相對(duì)親和力(Relativeaffinity):Relativeaffinity=Kd.bestTFOKd.expTFOaffinity=Κd.bestΤFΟΚd.expΤFΟ式中Kd.bestTFO為本實(shí)驗(yàn)體系中篩選出的最好的TFO與靶序列雜交形成的三鏈DNA的解離常數(shù),Kd.expTFO為本實(shí)驗(yàn)所測(cè)各TFO與靶序列雜交形成的三鏈DNA的解離常數(shù)。1.5降解a/c三鏈DNA結(jié)合反應(yīng)方法同凝膠滯留試驗(yàn),取結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物8μl,加DNase1(終濃度15U/ml)、消化1min,加98%去離子甲酰胺-10mol/LEDTA-0.25%二甲苯青FF液5μl終止反應(yīng),90°C水浴變性5min,點(diǎn)樣于12%變性聚丙酰胺凝膠上,以1800V恒電壓,電泳2h,抽干凝膠,進(jìn)行放射自顯影。同時(shí)按快速M(fèi)axam-Gilbort測(cè)序法測(cè)靶DNA的A+G序列。2結(jié)果2.1同聚氧化酶tfo及堿基配對(duì)堿基穩(wěn)定性的影響本研究寡核苷酸設(shè)計(jì)滿足以下兩個(gè)條件:①位于基因調(diào)控區(qū)(HBVC啟動(dòng)子);②TFO的靶序列類似于同聚嘌呤序列(1734～1754)。設(shè)計(jì)TFO時(shí)我們注意到了堿基配對(duì)方式對(duì)堿基三聯(lián)體穩(wěn)定性的影響,為避免非典型三聯(lián)體形成,我們針對(duì)純同聚嘌呤區(qū)(1744～1754),以堿基配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方式,合成了4條11nt寡核苷酸;為了考察增加TFO長(zhǎng)度對(duì)三鏈DNA形成的影響,還合成了1條21nt寡核苷酸,為排除TFO與雙鏈DNA非特異性結(jié)合的可能性,同時(shí)合成無(wú)關(guān)靶序列2和TFOc作為對(duì)照,見圖1。2.2與靶序列的結(jié)合在37°C、pH7.4環(huán)境中,分別將5種TFO以漸增濃度(0,5×10-11,2.5×10-10,5×10-10,2.5×10-9,5×10-9,2.5×10-8,5×10-8,2.5×10-7,5×10-7,2.5×10-6,5×10-6mol/L)與1pmol32P標(biāo)記靶序列(target1)雜交,用聚丙酰胺凝膠電泳分離,然后進(jìn)行放射自顯影。結(jié)果:①CT-TFO、GT-TFOp在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的濃度范圍內(nèi)均不能與靶序列結(jié)合{只見雙鏈靶DNA帶(duplex),無(wú)三鏈DNA帶出現(xiàn)};②GT-TFOap達(dá)5×10-8、AG-TFOs在2.5×10-9、AG-TFO1達(dá)2.5×10-9mol/L以上時(shí),即能與32P-靶DNA結(jié)合{在雙鏈靶DNA帶后方,出現(xiàn)三鏈DNA帶(triplex)};③當(dāng)GT-TFOap和AG-TFOs濃度達(dá)最高值時(shí),三鏈DNA帶前方仍然存在雙鏈DNA帶;④當(dāng)AG-TFO1濃度達(dá)2.5×10-8mol/L時(shí),雙鏈DNA帶消失,只有三鏈DNA帶存在,見圖2。用薄層掃描儀分析X線片顯影帶的光密度,按前述方法計(jì)算出各TFO與靶序列形成三鏈DNA的解離常數(shù)及相對(duì)親和力,見表1。結(jié)果顯示,在37°C、pH7.4條件下,CT-TFO、GT-TFOp與32P-靶DNA結(jié)合的親和力十分微弱,其Kd均>>10-6mol/L,即使寡核苷酸濃度高達(dá)10-6mol/L,仍不能與靶序列結(jié)合成三鏈DNA。在相同條件下,GT-TFOap、AG-TFOs與靶序列結(jié)合的親和力較高;Kd分別為5×10-7mol/L,2.5×10-8mol/L。四條短寡核苷酸中AG-TFOs的Kd值最低,提示其與靶序列結(jié)合的親和力相對(duì)較高。與短AG寡核苷酸相比,21ntAG寡核苷酸與靶序列結(jié)合的親和力更高,Kd為3×10-9mol/L。2.3ag-tfol與靶序列雜交成三鏈dna的酶足跡試驗(yàn)?zāi)z留滯試驗(yàn)結(jié)果顯示(見圖2),對(duì)照寡核苷酸不能與靶序列(targetl)雜交成三鏈DNA(lane3);5×10-6mol/LAG-TFOl也不能與對(duì)照靶序列(target2)雜交成三鏈DNA(lane2)。對(duì)AG-TFO1與靶序列形成的三鏈DNA作酶足跡試驗(yàn),經(jīng)DNA酶切后電泳,放射顯影結(jié)果顯示見圖3。在靶序列純同聚嘌呤區(qū),隨著AG-TFOl濃度增高,逐漸形成一清晰的足跡(無(wú)DNA條帶),但在三鏈DNA中部的兩個(gè)非典型堿基三聯(lián)體處仍可見DNA條帶;對(duì)照寡核苷酸則無(wú)足跡效應(yīng)(有DNA條帶)。3tfo與靶序列的結(jié)合HBVC啟動(dòng)子負(fù)責(zé)調(diào)控前基因組RNA和前CmRNA的轉(zhuǎn)錄,而前基因組RNA不僅是翻譯HBV核殼蛋白,HBV-DNA多聚酶的信息RNA,也是逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制HBV的模板,阻斷該區(qū)可阻止HBV-DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制,故我們選擇此區(qū)類似同聚嘌呤序列(1734～1745)為靶位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)合成的寡核苷酸分為二類,嘧啶型寡核苷酸(CT-TFO)和嘌呤型寡核苷酸(AG-TFO和GT-TFO)。理論上,嘧啶型寡核苷酸能與靶序列嘌呤鏈中的嘌呤間形成Hoogsteen氫鍵而形成三鏈DNA;但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在生理溫度和pH范圍內(nèi),CT-TFO不能與靶序列結(jié)合,可能與本實(shí)驗(yàn)的pH值高于該類寡核苷酸所要求的酸性環(huán)境有關(guān),說(shuō)明未經(jīng)改造或修飾的CT-TFO不適用于生理?xiàng)l件下的HBV轉(zhuǎn)錄抑制實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)兩條GT-TFO(GT-TFOp,GT-TFOap)所含堿基數(shù)目和堿基排列順序完全相同,但方向相反,GT-TFOp與靶鏈的方向平行,GT-TFOap與靶鏈的方向逆平行;理論上,含GT的TFO能通過(guò)Hoogsteen或逆Hoogsteen氫鍵平行或逆平行地與靶序列嘌呤鏈結(jié)合;但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GT-TFOap能與靶序列結(jié)合,而GT-TFOp則否,可能與這兩條GT-TFO含成串的G有關(guān),因含成串G的TFO易與靶序列同聚嘌呤鏈逆平行方向結(jié)合。本研究表明,AG-TFOs亦可與靶序列結(jié)合。比較AG-TFOs和GT-TFOap這兩條11nt寡核苷酸與靶序列的親和力,AG-TFOs高于GT-TFOap,說(shuō)明在四種短TFO中,以AG-TFOs最好。在從4條11nt寡核苷酸中篩選出最好的AG-TFOs的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步延長(zhǎng)AG-TFOs長(zhǎng)度至21nt,以探討TFO長(zhǎng)度對(duì)TFO與靶序列結(jié)合的親和力和特異性的影響,結(jié)果表明21ntAG-TFO與靶序列結(jié)合的親和力相當(dāng)于11ngAG-TFOs的8.3倍,提示在一定范圍內(nèi),增加TFO鏈長(zhǎng)度,有助于提高TFO與靶序列結(jié)合的親和力。對(duì)AG-TFOl與靶序列形成的三鏈DNA作酶足跡試驗(yàn)結(jié)果顯示,在純同聚嘌呤區(qū)有清晰的足跡(無(wú)DNA條帶),說(shuō)明此段三鏈DNA中的典型堿基三聯(lián)體結(jié)合牢固,從而保護(hù)靶鏈,不為DNA酶所切開;但在靶序列中部的兩個(gè)胸腺嘧啶處,卻無(wú)足跡形成(有DNA條帶),說(shuō)明此處的非典型堿基三聯(lián)體(C*TA)結(jié)合松散,對(duì)DNA酶抵抗力弱,不能保護(hù)靶鏈,盡管我們選擇了在非典型堿基三聯(lián)體中最穩(wěn)定的胞嘧啶與胸腺嘧啶的配對(duì)方式。提示在設(shè)計(jì)TFO時(shí),應(yīng)權(quán)衡增加TFO長(zhǎng)度的利弊,所選靶序列中嘧啶堿基的量越多,三鏈DNA的穩(wěn)定性將越差。本研究凝膠留滯試驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照寡核苷酸不能與靶序列雜交成三鏈DNA,高濃度AG-TFOl也不能與對(duì)照靶序列雜交成三鏈DNA;酶足跡試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照寡核苷酸無(wú)足跡效應(yīng)。說(shuō)明AG-TFOl與靶序列DNA結(jié)合成三鏈DAN具有高度的特異性。本實(shí)驗(yàn)中,我們還觀察到11ntAG-TFOs和11ntGT-TFOα的濃度達(dá)最高值時(shí),反應(yīng)體系中仍有雙鏈DNA存在,可能是因?yàn)檫@兩種寡核苷酸中的G易形成自身相關(guān)結(jié)構(gòu),如G四聚體、二聚體等,降低了TFO與靶序