CFX-熒光定量PCR儀操作指南(Bio-rad)

CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀操作流程及注意事項(xiàng)開(kāi)始運(yùn)行儀器打開(kāi)電腦打開(kāi)定量PCR儀底座開(kāi)關(guān)啟動(dòng)CFXManager軟件

放置樣品將PCR反應(yīng)體系加入到0.2ml低緣八聯(lián)管，蓋上管蓋；或加入低緣96孔板，用光學(xué)級(jí)封膜封好。注意，必須帶一次性塑料手套，不要讓手指接觸到反應(yīng)管表面。將反應(yīng)管按順序放入儀器的加熱孔中。

設(shè)置程序，運(yùn)行實(shí)驗(yàn)定量PCR軟件操作基本步驟為：a.設(shè)置熱循環(huán)程序文件（ProtocolTab）

“StartRun”鍵，運(yùn)行程序熱循環(huán)程序文件（ProtocolTab）設(shè)置指南：點(diǎn)擊Edit（編輯）或CreateNew（創(chuàng)建新程序）。反應(yīng)板設(shè)置文件（PlateTab）設(shè)置指南：選擇本次實(shí)驗(yàn)所要使用的熒光染料種類(lèi)；單擊樣品類(lèi)型；如要某些反應(yīng)孔第一熒光染料對(duì)應(yīng)的樣品類(lèi)型為標(biāo)準(zhǔn)品（Standard），點(diǎn)擊“DilutionSeries”鍵可設(shè)置其標(biāo)準(zhǔn)品濃度及稀釋倍數(shù)。點(diǎn)擊“StartRun”鍵。單擊openlid（打開(kāi)熱蓋）或Closelid（關(guān)閉熱蓋）放置樣品；單擊StartRun，保存文件，開(kāi)始運(yùn)行程序。

結(jié)果分析PCR反應(yīng)結(jié)束后，軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和Ct值等。如需進(jìn)行表達(dá)量分析、等位基因分析等，在軟件窗口選擇相應(yīng)分析功能。點(diǎn)擊右上方的“Report”鍵，還可輸出結(jié)果報(bào)告單

關(guān)閉運(yùn)行儀器實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出反應(yīng)管，順序關(guān)閉CFXManager軟件、定量PCR儀電源，關(guān)閉電腦。注意！CFX儀器上蓋部分為全自動(dòng)控制，在通電狀態(tài)，嚴(yán)禁任何人為干涉上蓋開(kāi)啟或關(guān)閉的行為，此類(lèi)行為會(huì)導(dǎo)致上蓋故障，危及儀器使用。

CFXManager軟件操作快速指南實(shí)驗(yàn)操作程序設(shè)置圖1顯示實(shí)驗(yàn)設(shè)置窗口中一個(gè)預(yù)覽的程序。點(diǎn)擊

CreateNew，打開(kāi)程序編輯器創(chuàng)建一個(gè)新的程序。點(diǎn)擊

SelectExisting，通過(guò)瀏覽器加載一個(gè)程序或?qū)ζ溥M(jìn)行編輯。使用ExpressLoad下拉菜單直接加載一個(gè)程序或?qū)ζ溥M(jìn)行編輯。點(diǎn)擊

EditSelected，打開(kāi)程序編輯器編輯所選程序的各個(gè)步驟。點(diǎn)擊

StartRun開(kāi)始運(yùn)行當(dāng)前加載的程序。程序編輯器程序編輯器可用來(lái)創(chuàng)建一個(gè)新程序或編輯一個(gè)已存在的程序，圖2。

1．在圖形或文本模式下選擇任何需要編輯的一步（該步驟會(huì)用藍(lán)色高亮顯示），點(diǎn)擊溫度或保持時(shí)間進(jìn)行直接編輯。2．點(diǎn)擊

InsertStep在程序中增加一個(gè)溫度步驟。點(diǎn)擊

DeleteStep在程序中刪除選中的步驟。3．點(diǎn)擊

AddPlateReadtoStep，在程序中指定獲取熒光數(shù)據(jù)的時(shí)間。如果當(dāng)前的高亮顯示步驟已經(jīng)進(jìn)行了讀板設(shè)置，則這一選項(xiàng)變?yōu)镽emovePlateRead。如果在這一步不想獲取數(shù)據(jù)，則點(diǎn)擊

RemovePlateRead。4．點(diǎn)擊GOTO步驟的重復(fù)次數(shù)，改變程序中的循環(huán)次數(shù)，圖2第4步。點(diǎn)擊GOTO步驟數(shù)可改變GOTO循環(huán)中所包含的步驟。增加一個(gè)梯度步驟：1．在程序編輯控制窗口中，點(diǎn)擊

InsertGradient，圖2。2．對(duì)梯度中最低和最高溫度值進(jìn)行編輯，在圖形模式，文本模式下或出現(xiàn)在文本模式右側(cè)的梯度范圍計(jì)算器中直接點(diǎn)擊數(shù)值進(jìn)行編輯，圖3。

3．在梯度范圍計(jì)算器中，對(duì)任何一行都可以賦予一個(gè)指定的溫度。每行的溫度都會(huì)調(diào)整為合適的溫度來(lái)滿(mǎn)足指定的溫度范圍。增加熔解曲線(xiàn)：1．在程序編輯控制窗口中，點(diǎn)擊

InsertMeltCurve，圖2。2．在圖形或文本顯示模式下，點(diǎn)擊溫度值來(lái)編輯融解曲線(xiàn)范圍的最低和最高溫度，圖4第5步。3．點(diǎn)擊增量值來(lái)編輯數(shù)據(jù)獲取的溫度區(qū)間。4．點(diǎn)擊保持時(shí)間編輯每一個(gè)增量溫度的保持時(shí)間。

CFXManager軟件數(shù)據(jù)分析快速指南

定量分析數(shù)據(jù)瀏覽擴(kuò)增圖表可以顯示實(shí)驗(yàn)中每個(gè)循環(huán)每個(gè)孔收集的相對(duì)熒光信號(hào)曲線(xiàn)。點(diǎn)擊位于擴(kuò)增圖表下方的熒光檢查窗，選擇需要顯示的熒光數(shù)據(jù)，圖1。在孔選擇器中點(diǎn)擊孔，行或列來(lái)顯示所選孔的熒光數(shù)據(jù)，圖1。選中的孔是藍(lán)色的，未選中的孔是亮灰色的。若把光標(biāo)置于熒光信號(hào)曲線(xiàn)上，孔選擇器中的孔上，數(shù)據(jù)電子表格的孔上，或者標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上均可以顯示出相應(yīng)的信息。數(shù)據(jù)分析選項(xiàng)CFXManager軟件可以自動(dòng)的扣除從各個(gè)孔所得數(shù)據(jù)的基線(xiàn)。從菜單欄中選擇

Settings，選擇BaselineThreshold可以改變基線(xiàn)范圍。軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算基線(xiàn)的位置?？梢渣c(diǎn)擊并拖動(dòng)閥值線(xiàn)來(lái)手動(dòng)定位。點(diǎn)擊工具欄中View/EditPlate按鈕來(lái)編輯孔的內(nèi)容，可以臨時(shí)創(chuàng)建新的分群，從分析中增加或刪掉一些孔。圖表選項(xiàng)可用鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊任何圖表來(lái)復(fù)制或保存圖像，或選擇

ChartOptions來(lái)改變軸范圍或刪除柵格，圖2。點(diǎn)擊工具欄中

TraceStyles按鈕，或鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊任何圖表來(lái)設(shè)定制定孔的熒光信號(hào)曲線(xiàn)顏色。鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊任何圖表，向下和拖動(dòng)光標(biāo)可以放大圖表?？椎姆秩簲?shù)據(jù)瀏覽使用工具欄中SelectWellGroup下拉菜單來(lái)瀏覽指定孔的分群數(shù)據(jù)，圖3。軟件可以針對(duì)每個(gè)分群作為獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)來(lái)處理，每一個(gè)分群可針對(duì)自己的設(shè)置進(jìn)行分析，如進(jìn)行自身標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的分析。定量數(shù)據(jù)分析顯示選項(xiàng)點(diǎn)擊數(shù)據(jù)分析窗口中

QuantitationData，瀏覽數(shù)據(jù)計(jì)算和統(tǒng)計(jì)，包括每個(gè)孔的閥值（CT）和平均值以及復(fù)制的標(biāo)準(zhǔn)偏差，圖4。點(diǎn)擊任一列的標(biāo)題進(jìn)行基于列的行分類(lèi)。鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊電子表格并選擇

Sort可進(jìn)行基于多個(gè)列的行分類(lèi)。鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊任一列的標(biāo)題并向左或向右拖動(dòng)可以重新排列電子表格中列的順序。鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊電子表格，選擇數(shù)據(jù)輸出格式如text，XML或Excel輸出數(shù)據(jù)，圖4。從

QuantitationData下拉菜單中選擇

Plate，在反應(yīng)板柵格模式下顯示所選熒光的孔數(shù)據(jù)。創(chuàng)建報(bào)告顯示選項(xiàng)點(diǎn)擊數(shù)據(jù)分析窗口工具欄中

Report按鈕，圖1，打開(kāi)Report窗口，圖5。點(diǎn)擊報(bào)告選項(xiàng)列表中的檢查窗，使制定信息包含在報(bào)告中，這些信息在預(yù)覽部分中會(huì)有所顯示，圖5。點(diǎn)擊工具欄中

File并選擇

Save，以PDF格式保存報(bào)告，或選擇Print打印報(bào)告。也可以保存報(bào)告為其它的文件格式。CFXManager軟件基因表達(dá)分析快速指南

通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量控制，您可以使用GeneExpressionModuleofCFXManager軟件來(lái)評(píng)估樣品之間靶標(biāo)濃度的相對(duì)差異。這種應(yīng)用最常用的使用是評(píng)估cDNA樣品中靶標(biāo)的濃度來(lái)推斷其mRNA水平。通常，一個(gè)或多個(gè)參照基因的含量被用來(lái)衡量目標(biāo)基因的水平。參照基因用來(lái)校正上樣的差異或各樣品取樣的差異。通過(guò)生物學(xué)條件的研究，參照基因的表達(dá)水平通常不發(fā)生變化。基因表達(dá)分析設(shè)置圖1顯示各樣品孔含單一的熒光，四個(gè)復(fù)制類(lèi)群，包含兩個(gè)不同靶標(biāo)名稱(chēng)和兩個(gè)不同的樣品名稱(chēng)。指定參照基因1．點(diǎn)擊反應(yīng)板編輯器中

ExperimentSettings或GeneExpressionModule，打開(kāi)實(shí)驗(yàn)設(shè)置窗口，圖2。

2．選擇

Targets。3．點(diǎn)擊合適的檢查窗選擇將被使用為參照基因的靶標(biāo)。4．點(diǎn)擊

ShowAnalysisSettings檢查窗，為靶標(biāo)設(shè)置反應(yīng)擴(kuò)增效率。5．AutoEfficiency檢查窗被默認(rèn)設(shè)定。如果實(shí)驗(yàn)中運(yùn)行一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中計(jì)算得到的擴(kuò)增效率將在計(jì)算中被使用?；蛘邔?duì)合適的靶標(biāo)輸入指定反應(yīng)擴(kuò)增效率值，則計(jì)算中將使用這一擴(kuò)增效率值。指定對(duì)照樣本1．在

ExperimentSettings窗口，選擇

Samples標(biāo)簽。2．點(diǎn)擊合適的檢查窗，選擇在計(jì)算中將被作為對(duì)照的樣本，圖3。對(duì)每個(gè)基因來(lái)說(shuō)，對(duì)照樣本的值被指定為1，同時(shí)所有其他樣本相對(duì)于對(duì)照樣本的值會(huì)被顯示出來(lái).

基因表達(dá)分析選擇分析模式1．從Mode下拉菜單中選擇分析模式，圖4：

a.NormalizedExpression⊿⊿C（t）-靶標(biāo)基因的相對(duì)量可通過(guò)樣本的參照基因來(lái)進(jìn)行相對(duì)量的衡量。⊿C（t）-靶標(biāo)基因的相對(duì)量不能被衡量；結(jié)果顯示的是實(shí)驗(yàn)中靶標(biāo)基因相對(duì)于其他樣品的基因濃度。

圖形選項(xiàng)1

GraphData下拉菜單中選擇對(duì)照相關(guān)或零相關(guān)的圖形數(shù)據(jù)。在表中，GraphData選項(xiàng)默認(rèn)是對(duì)照相關(guān)。2

X軸下拉菜單中選擇X軸以Sample顯示或Target顯示。3

Y軸下拉菜單中選擇Linear，Log2或Log10作為Y軸刻度。4

ScalingOption下拉菜單中選擇Highest，Lowest或Unscaled。5

ErrorType下拉菜單中選擇StandardErrorofthe