被動運動和香丹注射液對失神經(jīng)大鼠骨密度和骨代謝指標的影響

被動運動和香丹注射液對失神經(jīng)大鼠骨密度和骨代謝指標的影響

周圍神經(jīng)損傷引起的骨關(guān)節(jié)炎是康復(fù)醫(yī)學(xué)和運動醫(yī)學(xué)面臨的主要問題。根據(jù)動物實驗的研究，早期被動運動和藥物干預(yù)可以在一定程度上防止不必要的骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，促進不必要后骨的恢復(fù)。然而，這些藥物的臨床應(yīng)用效果并不滿意。因此，我們積極尋找非損傷藥物的預(yù)防和中斷，以具有很高的實際意義。目前有研究提示香丹注射液有良好的改善骨質(zhì)作用,且具有價格低廉,副作用小的優(yōu)勢,為進一步探索其健骨機理,本文通過觀察被動運動和香丹注射液對失神經(jīng)大鼠的骨密度和骨代謝指標的影響,探討被動運動和香丹注射液對廢用性骨質(zhì)疏松的早期預(yù)防作用,以期為臨床探索新的防治方法和廢用性骨質(zhì)疏松病人的早期預(yù)防、康復(fù)治療提供科學(xué)的實驗依據(jù)。1材料和方法1.1大鼠單籠飼養(yǎng)3月齡雄性Wistar大鼠48只,體重240.12±20.32克(山東大學(xué)實驗動物中心提供),隨機分為假手術(shù)組、單純失神經(jīng)組、失神經(jīng)+被動運動組和失神經(jīng)+香丹組,每組12只。大鼠單籠飼養(yǎng),自由進食、飲水,以國家標準嚙齒類動物常規(guī)飼料喂養(yǎng)。環(huán)境溫度18~24℃,相對濕度45%~55%,每天光照時間12h,大鼠飼養(yǎng)籠具、飲水瓶定期消毒,使用墊料均經(jīng)高壓滅菌。1.2失神經(jīng)和術(shù)后被動運動大鼠的情況單純失神經(jīng)組、失神經(jīng)+被動運動組和失神經(jīng)+香丹組大鼠3%戊巴比妥鈉(25mg/kg)腹腔麻醉,先將大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺,在左后肢股骨近段和尾部近段剃毛,以碘伏消毒、鋪巾,觸摸到股骨大轉(zhuǎn)子后,在股骨大轉(zhuǎn)子與靠近尾部之間與后外方45°方向行長約1cm切口,逐層分離,在半腱肌、半膜肌和股二頭肌之間找到坐骨神經(jīng),靠近上段予以切除5mm,并將神經(jīng)斷端打結(jié)處理以預(yù)防斷端包塊的形成,用硫酸慶大霉素沖洗切口,然后縫合切口;再置大鼠于仰臥位,腹股溝處正中縱向切口,水平切斷大鼠左側(cè)股神經(jīng),游離遠端5mm,同樣將神經(jīng)斷端進行打結(jié)處理,慶大霉素沖洗并縫合切口。手術(shù)后給予肌注慶大霉素0.1ml,以預(yù)防感染,每天用酒精棉球和碘酒擦拭傷口,直至傷口愈合(大約5天左右)。假手術(shù)組只分離坐骨神經(jīng)和股神經(jīng),然后縫合切口。手術(shù)后假手術(shù)組、單純失神經(jīng)組進行籠養(yǎng),不給予任何干預(yù)措施。失神經(jīng)+被動運動組大鼠于手術(shù)后第3天,觀察傷口基本愈合,對其進行被動運動,首先進行2天預(yù)運動,大約3天左右動物已經(jīng)基本適應(yīng)被動運動且傷口已經(jīng)痊愈。被動運動操作時雙手戴上加厚手套,一手固定大鼠于俯臥位,另一手抓住左后肢(手術(shù)側(cè))趾部,與脊柱呈45°向后外方向牽拉,直至左后肢完全伸直(膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)均伸直),然后再向與牽拉方向相反的方向,將左后肢推向身體使之完全屈曲緊貼身體(膝關(guān)節(jié)完全屈曲,踝關(guān)節(jié)完全背屈),如此一個往復(fù)為一個周期。2次/天,5分鐘/次,每側(cè)后肢每天共活動600個周期。整個過程中動作輕柔,速度適中,全關(guān)節(jié)幅度活動,初期以傷口不滲血為度。失神經(jīng)+香丹組大鼠于手術(shù)后第3天,給予香丹注射液(四川三精升和制藥有限公司,批準文號:國藥準字Z51021309)灌胃,按15g·kg-1·d-1予以灌胃,持續(xù)30天。1.3血清凍存實驗進行30天后,大鼠行頸靜脈取血,離心,取血清,-40℃凍存。分離大鼠左側(cè)股骨、脛骨,剔除軟組織,稱重后用浸透生理鹽水的紗布包裹放入試管中,標記,-40℃凍存待測。1.4lar和tracp5b的測定血鈣的測定采用鄰甲酚酞絡(luò)合酮終點比色法,堿性磷酸酶(ALP)的測定采用連續(xù)監(jiān)測法,試劑購自羅氏公司,日本產(chǎn)MODULAR全自動生化分析儀測定;骨鈣素(BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)測定采用酶免法,試劑盒購自美國ADL公司,MULTISCANMK3酶標儀測定;應(yīng)用美國Norland公司pDEXA型雙能X線骨密度儀測定脛骨中段、遠段的骨礦含量,所有脛骨均擺放同一位置,結(jié)果以g/cm2表示,其中以骨中段代表皮質(zhì)骨骨密度,遠段代表松質(zhì)骨骨密度。1.5統(tǒng)計學(xué)處理方法所有數(shù)據(jù)結(jié)果均用平均值±標準差(Mean±SD)表示,數(shù)理統(tǒng)計采用統(tǒng)計軟件SPSS11.5進行單因素方差分析(One-wayANOVA),組間相互比較采用LSD法,P<0.05代表顯著性差異,P<0.01代表極顯著性差異。2結(jié)果2.1不同方法灌胃對大鼠足部水腫的影響大鼠手術(shù)后30min左右清醒,單純失神經(jīng)組、失神經(jīng)+被動運動組和失神經(jīng)+香丹組大鼠左后肢無主動屈伸功能,后爪屈曲,以腳掌支持體重,軀體重心減低并前移,前進時以臀部肌群幫助行走,后退時靠腰部肌群收縮代償,手術(shù)后大鼠活動量明顯減少。被動運動和香丹注射液灌胃3天后,大鼠足部腫脹減退較單純失神經(jīng)組明顯,活動量逐漸加大。實驗結(jié)束時,單純失神經(jīng)組大鼠2只出現(xiàn)輕微足趾部壞疽現(xiàn)象,其他各組未見此現(xiàn)象,提示被動運動和香丹注射液灌胃可能具有促進失神經(jīng)大鼠微循環(huán)增強的功能。單純失神經(jīng)組的統(tǒng)計結(jié)果剔除這2只的結(jié)果,不在統(tǒng)計范圍之內(nèi)。2.2各組大鼠股骨重量的比較實驗30天后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組大鼠股骨的重量無顯著性差異,但單純失神經(jīng)組、失神經(jīng)+被動運動組和失神經(jīng)+香丹組大鼠股骨重量與假手術(shù)組相比有降低的趨勢;單純失神經(jīng)組大鼠脛骨的重量顯著低于假手術(shù)組(P<0.05),提示切斷一側(cè)坐骨神經(jīng)和股神經(jīng)抑制了大鼠骨的生長。2.3大鼠骨礦含量實驗30天后結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比,單純失神經(jīng)組、失神經(jīng)+被動運動組和失神經(jīng)+香丹組股骨骨密度均顯著性降低(P<0.05);單純失神經(jīng)組大鼠脛骨皮質(zhì)骨骨密度顯著低于假手術(shù)組(P<0.05),單純失神經(jīng)組、失神經(jīng)+被動運動組松質(zhì)骨骨密度極顯著低于假手術(shù)組(P<0.01),表明切斷一側(cè)坐骨神經(jīng)和股神經(jīng)延緩了大鼠骨礦含量的增加。與單純失神經(jīng)組、失神經(jīng)+被動運動組相比,失神經(jīng)+香丹組脛骨遠端松質(zhì)骨骨密度顯著性升高(P<0.05),提示香丹注射液具有促進松質(zhì)骨骨礦含量增加的作用,且較被動運動效果顯著。2.4酸性磷酸酶5b水平各組大鼠血鈣水平比較無顯著性差異,與假手術(shù)組相比,單純失神經(jīng)組反映骨吸收的指標抗酒石酸酸性磷酸酶5b水平顯著升高(P<0.05),表明切斷一側(cè)坐骨神經(jīng)和股神經(jīng)促進了骨吸收;與單純失神經(jīng)組相比,失神經(jīng)+被動運動組和失神經(jīng)+香丹組反映骨形成的指標堿性磷酸酶、骨鈣素水平顯著升高(P<0.05),提示被動運動和香丹注射液均具有促進失神經(jīng)大鼠骨形成的作用。3被動運動治療廢用性骨髓培養(yǎng)方面研究顯示周圍神經(jīng)損傷可導(dǎo)致廢用性骨質(zhì)疏松的發(fā)生,李明等觀察切除大鼠一側(cè)坐骨神經(jīng)12天其脛骨即產(chǎn)生明顯廢用性骨質(zhì)疏松,Biewener等報道切斷雞的一側(cè)坐骨神經(jīng),其骨密度降低而且皮質(zhì)骨面積減少,本文結(jié)果顯示切斷大鼠的一側(cè)坐骨神經(jīng)和股神經(jīng),脛骨的重量、股骨和脛骨的骨密度均顯著性降低,表明大鼠失神經(jīng)支配后可抑制骨的生長。同時本文測定模型組大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶5b顯著性高于假手術(shù)組,提示切斷一側(cè)坐骨神經(jīng)和股神經(jīng)造成的廢用性骨質(zhì)疏松是由于骨吸收增強導(dǎo)致,與Yeh等研究結(jié)果一致,但Wakley等報道失神經(jīng)導(dǎo)致的骨量下降主要是骨形成指標如骨鈣素和堿性磷酸酶mRNA水平的降低,而骨吸收無變化,其具體原因還有待于進一步實驗證明。失神經(jīng)導(dǎo)致骨量下降的原因是多因素的,一方面由于肌肉收縮、體力活動等力學(xué)因素引起的外力作用下降,導(dǎo)致肢體的廢用;另一方面神經(jīng)的營養(yǎng)作用削弱或消失以及骨內(nèi)微循環(huán)障礙均可能成為骨量降低的致因。被動運動操作簡單、方便、安全,許多動物實驗研究表明被動運動可以改善失神經(jīng)大鼠廢用性骨質(zhì)疏松現(xiàn)象,高潤等報道被動運動治療可延緩失神經(jīng)大鼠的骨量下降,李軍漢等報道被動運動治療可減緩失神經(jīng)大鼠股骨生物力學(xué)性能的改變,馬學(xué)軍報道失神經(jīng)大鼠經(jīng)28天被動運動后骨堿性磷酸酶活性明顯提高,本文結(jié)果顯示失神經(jīng)大鼠經(jīng)30天被動運動后堿性磷酸酶和骨鈣素顯著升高,表明早期進行被動運動通過機械牽拉作用使骨組織產(chǎn)生和保持一定的力學(xué)刺激,同時改善了靜脈、淋巴淤滯現(xiàn)象,進而增強了骨代謝,通過加快成骨過程從而延緩了廢用性骨質(zhì)疏松的發(fā)生。但本研究尚未出現(xiàn)骨密度的提高,分析原因可能是由于被動運動只是微弱地引起肌張力升高,對骨進行牽拉產(chǎn)生的力學(xué)刺激作用較小以及作用時間較短等因素有關(guān),結(jié)果提示被動運動在治療廢用性骨質(zhì)疏松的具體應(yīng)用及其影響機制尚需進一步探討。目前治療廢用性骨質(zhì)疏松手段的臨床應(yīng)用療效尚不滿意,關(guān)于更有效的康復(fù)、治療措施仍在積極探索中,中藥因其價格低廉,組方靈活,副作用小等優(yōu)勢得以廣泛應(yīng)用。藥理研究表明,丹參有擴張冠狀動脈、增加冠脈流量的作用,故常用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞等疾病,且能改善血瘀患者的血液流變學(xué),并證實無不良影響。張杰等報道香丹注射液在家兔骨折中后期具有明顯促進骨折愈合的作用,劉國雄等報道復(fù)方丹參制劑可顯著抑制由于長期服用潑尼松致骨質(zhì)丟失現(xiàn)象,且有一定的量效關(guān)系,以上研究表明復(fù)方丹參制劑能夠起到改善骨質(zhì)的作用,目前關(guān)于香丹注射液對失神經(jīng)后骨變化的影響尚未見文獻報道。本文結(jié)果顯示香丹注射液顯著性提高了脛骨遠端松質(zhì)骨骨密度,堿性磷酸酶、骨鈣素水平顯著升高,且較被動運動效果顯著,表明香丹注射液具有促進骨形成,延緩骨丟失的作用,結(jié)果提示香丹注射液可能成為臨床治療廢用性骨質(zhì)疏松的有效手段,以上結(jié)果也為擴大香丹注射液的臨床適應(yīng)癥范圍以及將其用于廢用性骨質(zhì)疏松的康復(fù)治療提供了實驗依據(jù)。香丹注射液服用方便、經(jīng)濟,其成分為丹參、降香,丹參活血化瘀,降香理氣開竅,二者合用有協(xié)同作用,其影響機制可能是香丹注射液通過活血化淤作用改善了遠端骨的血液循環(huán)和血氧供應(yīng),使代謝產(chǎn)物得以及時消除;同時促進成骨細胞的增殖和分化;增加骨的礦化作用來抵抗失神經(jīng)所致的骨丟失。另外,本研究發(fā)現(xiàn)其對骨密度的影響具有部位差異性,這可能是脛骨遠端的結(jié)構(gòu)與骨干相比,分布較多的血管、骨小梁,更適合香丹注射液藥理作用的發(fā)揮,但具體影響機制以及臨床應(yīng)用劑量、效果尚待更多實驗予以證實。4大鼠骨鈣素水平變化失神經(jīng)支配后,大鼠脛骨的重量、股骨和脛骨的骨密度顯著降低,抗