gf-1局部注射聯(lián)合自體骨髓移植對骨延遲愈合的促進(jìn)作用

gf-1局部注射聯(lián)合自體骨髓移植對骨延遲愈合的促進(jìn)作用

骨延遲匹配和非骨折是骨折的常見并發(fā)癥，發(fā)病率約為5%10%，治療困難。這是骨科臨床常見病之一，人們對此進(jìn)行了大量研究。本院課題組運(yùn)用轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)局部注射聯(lián)合經(jīng)皮自體骨髓移植治療兔橈骨骨折延遲愈合,取得了較好的實(shí)驗(yàn)效果。現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。1材料和方法1.1試劑轉(zhuǎn)化生長因子β1試劑(100μg/1ml)符合參考文獻(xiàn)方法,從人血小板中提純鑒定。1.2動(dòng)物1.3方法1.3.1菌條件下手術(shù)選取健康雄性新西蘭大耳白兔(2.0~2.5kg)40只,戊巴比妥鈉靜脈麻醉(30mg/kg),無菌條件下手術(shù),以實(shí)驗(yàn)白兔左前肢橈骨中段處為中心作一3cm長縱行切口,切開皮膚及淺筋膜,同時(shí)切除6mm長的橈骨與骨膜,骨折端髓腔用骨蠟封閉,造成骨缺損骨延遲愈合模型,逐層縫合,關(guān)閉切口無需內(nèi)、外固定。術(shù)后兔子自由活動(dòng),48小時(shí)后更換敷料,5天內(nèi)用青霉素40萬單位肌肉注射預(yù)防感染,按相同條件常規(guī)飼養(yǎng)。1.3.2自體血的檢測40只新西蘭白兔隨機(jī)分為空白對照組(A組)、骨髓移植組(B組)、TGF-β1組(C組)、試驗(yàn)組(D組),每組10只。骨缺損模型建立后5天和10天,分別再次麻醉各組實(shí)驗(yàn)白兔。16號骨髓穿刺針在任意一側(cè)白兔股骨大粗隆頂端進(jìn)入骨髓腔內(nèi),快速抽吸骨髓液2ml。同時(shí)用5號針頭從白兔的耳緣靜脈抽取自體血2ml。然后按如下要求治療:A組于骨延遲愈合區(qū)注入自體血液2ml,生理鹽水1ml;B組于骨延遲愈合區(qū)注入自體紅骨髓2ml,生理鹽水1ml;C組于骨延遲愈合區(qū)注入自體血液2ml,TGF-β11ml(100μg);D組于骨延遲愈合區(qū)注入自體紅骨髓2ml,TGF-β11ml。1.4觀察指標(biāo)1.4.1橈骨干片的he染色術(shù)后4周各組實(shí)驗(yàn)白兔應(yīng)用心內(nèi)注射過量戊巴比妥鈉(250mg/kg)隨機(jī)處死5只,取下左側(cè)橈骨用10%甲醛固定,混合脫鈣液脫鈣,逐級脫水,石蠟包埋,作5μm切片,HE染色,光鏡觀察。1.4.2平均體積的測定在HE染色切片上,取外骨痂遠(yuǎn)、中、近3個(gè)視野,利用微機(jī)圖像處理系統(tǒng)處理切片圖像,分別計(jì)算出骨折后4周骨痂內(nèi)骨生成細(xì)胞和成骨細(xì)胞的體積密度(Vvt)、數(shù)量密度(Nv)和平均體積(Vv)。1.4.3橈骨骨髓組織病理學(xué)測定各組實(shí)驗(yàn)白兔在術(shù)后8周應(yīng)用心內(nèi)注射過量戊巴比妥鈉(250mg/kg)處死,取骨痂標(biāo)本前完整取下左橈骨并清除周圍軟組織,用游標(biāo)卡尺測定橈骨骨痂中份矢狀面、冠狀面直徑以及斷端處骨痂厚度。根據(jù)阿基米德原理測定骨密度。1.4.4骨折愈合處力學(xué)特性的測定力學(xué)測試的橈骨在4小時(shí)內(nèi)完成取材,貯存在林格氏溶液中(4℃,pH7.4)。采用三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)方法測試骨折愈合處的力學(xué)特性。橈骨置于三點(diǎn)彎曲材料測試機(jī)(島津AG-20K1VA型),恒定變形率為5mm/min,跨距4cm,測定出最大抗彎強(qiáng)度(極限負(fù)荷)、極限應(yīng)力、極限剛度和極限負(fù)荷時(shí)的能量吸收。1.4.5通過測量單位質(zhì)量骨膠中的鈣含量取骨折近端骨痂,經(jīng)漂洗、脫脂、烘干后,精確稱重,用三氯乙酸0.1g/ml脫鈣,回滴定法測定鈣含量。1.5統(tǒng)計(jì)評估2.3骨瘤厚度和骨密度在骨折8周后,D組橈骨骨痂中份的冠狀徑和矢狀徑顯著性高于A組(P<0.05);骨痂厚度和骨密度非常顯著性高于A組(P<0.01);骨痂厚度改變顯著性高于B組和C組(P<0.05),而且B組和C組顯著性高于A組(P<0.05),結(jié)果見表2。2.4能量吸收顯著性D組骨折愈合處的最大抗彎強(qiáng)度、極限應(yīng)力、極限剛度和極限負(fù)荷時(shí)的能量吸收均非常顯著性高于A組(P<0.01),顯著性高于B組和C組(P<0.05);B組和C組極限應(yīng)力、極限剛度和極限負(fù)荷時(shí)的能量吸收,均非常顯著性高于A組(P<0.01),結(jié)果見表3。2.5各組顯著性比較D組骨痂中鈣含量[260.67±9.96(g/mg)]非常顯著性高于A組[222.04±13.91(g/mg)](P<0.01),顯著性高于B組[242.67±11.49(g/mg)]和C組[241.78±8.42(g/mg)](P<0.05),B組和C組顯著性高于A組(P<0.05)。3外源性tgf-1局部注射聯(lián)合經(jīng)皮自體骨髓移植促進(jìn)骨折愈合的必要性轉(zhuǎn)化生長因子可分為5大類,目前研究得較為清楚的是TGF-α和TGF-β。TGF-α可與EGF受體結(jié)合,激活酪氨酸激酶,最終引起細(xì)胞分裂。TGF-β具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用,特別在骨形成和骨重建過程中起著極為重要的作用。體外實(shí)驗(yàn)表明,TGF-β可促進(jìn)骨膜間充質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化,促進(jìn)骨(軟骨)細(xì)胞的增殖,刺激Ⅰ型膠原、骨連接素和骨橋蛋白的合成。Goujon在l869年通過兔子實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),骨髓具有成骨能力。20世紀(jì)60年代以來,一些研究者報(bào)道松質(zhì)骨主要由骨髓中的成骨干細(xì)胞分化而來。許多研究者已將骨髓的成骨能力應(yīng)用到實(shí)際工作中,如在異體骨移植的同時(shí)混入部分在手術(shù)中獲得的骨髓來增加移植骨的成骨特性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,Connolly等指出,骨髓的成骨能力和骨髓細(xì)胞濃度間存在正相關(guān),并且在臨床上通過單純自體骨髓移植成功地治愈了骨不連。最近的研究發(fā)現(xiàn),骨髓中結(jié)締組織母細(xì)胞在不同個(gè)體間存在著顯著的個(gè)體差異,然而,其有效性與移植骨髓中母細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)。自髂嵴獲取的骨髓如果不經(jīng)過濃縮處理,其母細(xì)胞數(shù)量并不能達(dá)到治療骨不連的理想數(shù)目。添加生長因子可以增加母細(xì)胞數(shù)量,提高自體骨髓移植促進(jìn)骨愈合的療效。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)。外源性TGF-β1可以增加母細(xì)胞數(shù)量,具有較強(qiáng)的促進(jìn)骨愈合作用。骨折延遲愈合多因感染、骨折段血供受損及固定不恰當(dāng)?shù)仍斐尚鹿巧蛇^程中成骨受阻,缺損間隙由纖維組織填充,骨端未能達(dá)到骨性愈合,形成骨折延遲愈合。目前有多種治療方法,物理方法有體外沖擊波、磁場體外誘導(dǎo)等;手術(shù)方法則在內(nèi)固定的同時(shí)于缺損區(qū)植入修復(fù)材料(骨材料,骨替代材料)來促進(jìn)骨折愈合。而目前最佳的修復(fù)材料,仍然是自體骨的移植及同種異體骨的運(yùn)用,但受到一定條件的限制。骨折修復(fù)的最終目的是盡可能恢復(fù)受傷骨的最大力學(xué)強(qiáng)度,修復(fù)骨折不僅要恢復(fù)骨骼形態(tài)的連續(xù)性,更重要的是要重建骨骼的支撐功能。骨折愈合后外力作用其上時(shí),會(huì)引起骨骼的變形,這些變形的性質(zhì)、大小與骨的幾何形狀、骨組織的材料特性有關(guān)。所以骨折愈合評估不能單獨(dú)從組織學(xué)方面的變化來研究,更重要的是要從骨折愈合后可承受負(fù)荷能力的生物力學(xué)參數(shù)來定量分析。因此,筆者運(yùn)用組織學(xué)方面研究兔橈骨骨折延遲愈合的同時(shí)又采用了生物力學(xué)方法,從結(jié)構(gòu)力學(xué)和材料力學(xué)方面,探討外源性TGF-β1局部注射聯(lián)合經(jīng)皮自體骨髓移植對兔橈骨骨折愈合后整體骨骼生物力學(xué)強(qiáng)度的影響。從愈合骨骼的幾何參數(shù)結(jié)果來看,TGF-β1聯(lián)合自體骨髓移植組在骨折愈合后的生物力學(xué)強(qiáng)度上,明顯優(yōu)于單用自體骨髓移植或者單用TGF-β1局部注射組,而后兩組明顯優(yōu)于空白對照組?？梢?在骨折區(qū)局部聯(lián)合注射TGF-β1及自體骨髓,可使骨折部位骨痂量、單位骨痂的鈣含量增加,有明顯促進(jìn)骨組織生成和骨折愈合作用并增強(qiáng)骨折愈合后的生物力學(xué)強(qiáng)度。綜上所述,本文的結(jié)論是,TGF-β1局部注射聯(lián)合經(jīng)皮自體骨髓移植能促進(jìn)骨折愈合,增強(qiáng)骨折愈合后的生物力學(xué)強(qiáng)度,兩者合用具有良好的協(xié)同作用,是治療骨折延遲愈合的一種有效方法。試驗(yàn)結(jié)果將為未來臨床開發(fā)應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。雄性新西蘭大耳白兔(2.0~2.5kg)由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。計(jì)量資料以表示,對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊性數(shù)據(jù)組間均數(shù)用LSD法檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,方差不齊性數(shù)據(jù)組間均數(shù)用Dunnett法檢驗(yàn)兩兩比較。2結(jié)果2.1如圖所示2.2成骨細(xì)胞測定結(jié)果術(shù)后4周,在骨痂內(nèi)骨生成細(xì)胞測定方面,D組的Vvt非常顯著性高于A組(P<0.01),B組、C組和D組的Vv非常顯著性高于A組(P<0.01)。在成骨細(xì)胞測定方面,D組的Vvt