糧食真菌檢驗(yàn)中的無(wú)菌控制

糧食真菌檢驗(yàn)中的無(wú)菌控制

食物是微生物自然營(yíng)養(yǎng)的集合。谷物不僅存在于糧食表面，也存在于糧食內(nèi)部。隨著糧食由田間轉(zhuǎn)入倉(cāng)庫(kù),微生物優(yōu)勢(shì)菌種類(lèi)也由田間真菌———交鏈孢霉等慢慢轉(zhuǎn)變?yōu)楦婢购颓嗝沟?。真菌?duì)糧食的品質(zhì)及其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性有很大的影響,極易產(chǎn)生代謝產(chǎn)物———黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素、雜色曲霉毒素等真菌毒素。為了確保測(cè)定結(jié)果中的真菌來(lái)源于糧食本身,真實(shí)反映糧食貯藏過(guò)程中的微生物種類(lèi)和數(shù)量,在檢驗(yàn)操作過(guò)程中應(yīng)對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行必要的無(wú)菌控制,采用安全有效的消毒滅菌技術(shù)。糧食中常見(jiàn)的真菌有:交鏈孢霉、根霉、毛霉、白曲霉、鐮刀菌、黃曲霉、棕曲霉、灰綠曲霉、雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉等。而江南溫潤(rùn)潮濕的氣候條件同樣適合青霉、毛霉和曲霉的生長(zhǎng)。隨著塵土從空氣中落到微生物實(shí)驗(yàn)室的各個(gè)地方,極易發(fā)生青霉、毛霉等交叉污染。因真菌類(lèi)微生物菌落較大,一旦形成優(yōu)勢(shì),可以覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿。因此,滅菌技術(shù)成為控制檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵,且貫穿于整個(gè)檢驗(yàn)過(guò)程,不論哪個(gè)環(huán)節(jié)造成污染都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性。在GB4789.1—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則》、GB4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》、GB4789.15—2010《霉菌和酵母計(jì)數(shù)》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中,對(duì)環(huán)境、設(shè)備、器械、實(shí)驗(yàn)材料等的消毒滅菌均未做出詳細(xì)說(shuō)明。因此,根據(jù)實(shí)際操作過(guò)程中的經(jīng)驗(yàn),選擇采用適當(dāng)?shù)南緶缇夹g(shù)就很有必要。1糧食微生物的培養(yǎng)基糧食微生物生長(zhǎng)的基質(zhì)是谷物,谷物的含水量較低,一般在11%~15%,長(zhǎng)期適應(yīng)在這類(lèi)基質(zhì)上生長(zhǎng)繁殖的微生物,也就適應(yīng)了較高滲透壓的環(huán)境,致使一些主要糧食微生物在普通培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不良。因此,選擇適合糧食微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是很重要的。在糧食真菌檢驗(yàn)中我們所采用的培養(yǎng)基是滲透壓較高的,能分離得到較多糧食微生物的改良察氏(Czapek-Dox)培養(yǎng)基,即在察氏培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加60gNaCl。具體配方為:蔗糖30g,NaNO32g,K2HPO41g,MgSO4·H2O0.5g,KCl0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,瓊脂20g,蒸餾水1000ml。2消毒和消毒為保證在糧食真菌檢驗(yàn)過(guò)程中處于無(wú)菌狀態(tài),對(duì)各類(lèi)器具與空間的消毒和滅菌可采用不同的方法。2.1培養(yǎng)基的密封高壓蒸汽滅菌法是將待滅菌的物品放進(jìn)一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi),通過(guò)加熱,使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸氣將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡后,關(guān)閉排氣閥,繼續(xù)加熱。此時(shí)由于蒸汽不再溢出,可使滅菌鍋內(nèi)的壓力增大,沸點(diǎn)增高,溫度達(dá)100℃以上,從而導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。培養(yǎng)基、無(wú)菌水、稱量紙的滅菌可采用高壓蒸汽滅菌法。將配好的培養(yǎng)基分裝在500ml三角瓶中,塞好棉塞(用普通棉花外面包紗布用線扎緊);分裝好無(wú)菌水(三角瓶225ml和試管9ml);稱量紙外面用油紙包好扎緊,然后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。此時(shí),滅菌鍋內(nèi)冷空氣排除是否完全極為重要。因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒魵獾呐蛎泬?當(dāng)水蒸氣中含有空氣時(shí),在同一壓力下,含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。高壓滅菌鍋留有不同分量空氣時(shí),滅菌效果不同。采用在0.10和0.14MPa壓力下,滅菌30min,對(duì)500ml三角瓶中培養(yǎng)基高壓滅菌鍋留有不同分量空氣(壓力升至0.05MPa時(shí),放氣閥排出空氣)時(shí)的滅菌效果進(jìn)行比較,在28~30℃恒溫箱培養(yǎng)5d后觀察,培養(yǎng)基污染情況見(jiàn)表1。從表1可以看出,放氣閥排出全部空氣,高壓滅菌鍋壓力升至0.10和0.14MPa,滅菌30min時(shí),培養(yǎng)基均沒(méi)有發(fā)生污染情況。因壓力表量程最高為0.14MPa,為安全起見(jiàn),高壓滅菌采用0.10MPa,121.5℃,30min,可達(dá)到徹底滅菌的效果。2.2紫外線照射與化學(xué)藥劑的使用效果無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)、地面、培養(yǎng)箱一般采用波長(zhǎng)為200~300nm的紫外線進(jìn)行殺菌消毒。由于輻射能使空氣中的氧電離成[O],再使氧氣生成臭氧。紫外線穿透力不大,照射距離為1.2m,為了加強(qiáng)紫外線消毒效果,減少紫外線對(duì)人體的傷害,同時(shí)又能達(dá)到滅菌效果,在實(shí)驗(yàn)中采用物理和化學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行滅菌。采用單一的紫外線照射與化學(xué)試劑結(jié)合使用作比對(duì),將3個(gè)打開(kāi)的平板培養(yǎng)基分別放置在超凈工作臺(tái)、桌面和地面15min后,放入28~30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d后觀察,結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出,采用2%~3%來(lái)蘇兒(煤酚皂液)和紫外線照射相結(jié)合的消毒方法效果良好,可以增強(qiáng)紫外線滅菌效果,照射時(shí)間可從30min減少到15min,減少了臭氧對(duì)人體的危害。因此,在打開(kāi)紫外燈前,先將無(wú)菌室內(nèi)的桌面、凳子用2%~3%的來(lái)蘇兒擦拭,然后再開(kāi)紫外燈照射,達(dá)到滅菌目的。同時(shí)間隔一周時(shí)間在無(wú)菌室內(nèi)噴灑3%~5%石炭酸溶液,以使空氣中附著微生物的塵埃落下并殺死一部分細(xì)菌,增強(qiáng)滅菌效果。培養(yǎng)箱同等操作。在無(wú)菌室紫外消毒時(shí)將工作衣、帽進(jìn)行消毒,雙手用75%酒精消毒,避免因人為因素造成的污染。2.3實(shí)驗(yàn)方法不同高溫能使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)。在菌體受熱時(shí),當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大,則蛋白質(zhì)凝固就越快,反之含水量越少,凝固越緩慢。因此,與濕熱滅菌相比,高溫干熱滅菌所需溫度要高,時(shí)間要長(zhǎng)。將培養(yǎng)皿(10個(gè)一卷)、吸量管(1、10ml,距管口3cm處塞1.5cm左右棉花,松緊適度)、試管分別用報(bào)紙包好,放入電烘箱中160℃滅菌2h,溫度不能超過(guò)180℃,否則報(bào)紙會(huì)被烤焦,引起燃燒。當(dāng)溫度下降到70℃以下再將物體取出。將培養(yǎng)基倒在160℃高溫滅菌2h后的培養(yǎng)皿上,經(jīng)28~30℃培養(yǎng)5d后觀察,結(jié)果為陰性。2.4日常檢測(cè)結(jié)果各類(lèi)器具與空間按照上述不同的方法進(jìn)行消毒滅菌,在每次檢測(cè)樣品時(shí)做2個(gè)空白培養(yǎng)皿進(jìn)行效果評(píng)價(jià),通過(guò)多次日常檢測(cè)觀察,結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,用以上滅菌技術(shù)控制檢驗(yàn)過(guò)程,可以達(dá)到良好的無(wú)菌效果。3火焰旁進(jìn)行在緩沖室內(nèi),用滅菌稱量紙迅速稱取25g糧食樣品到裝有225ml無(wú)菌水中,振蕩30min,在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行無(wú)菌操作。注意身體不要靠著超凈工作臺(tái),整個(gè)過(guò)程都在火焰旁進(jìn)行。先將培養(yǎng)皿和試管進(jìn)行編號(hào),吸取樣液10ml至試管中,另用1ml吸管反復(fù)吹吸混勻;取稀釋倍數(shù)10-1、10-2、10-3各1ml,分別接入相應(yīng)標(biāo)號(hào)的培養(yǎng)皿中,每個(gè)稀釋度接2個(gè)培養(yǎng)皿,待瓊脂冷卻到45℃時(shí)(用手背試感到不燙手)倒入約15~20ml左右,馬上搖勻冷卻,倒置,于28~30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7d,觀察。4真菌形態(tài)鑒定選擇菌落數(shù)在10~150個(gè)之間稀釋度培養(yǎng)皿的背面劃十字,按區(qū)域分別計(jì)數(shù)后相加,根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算菌落總數(shù),以獲得活菌的信息和污染程度。根據(jù)菌落形態(tài)、大小、色澤、邊緣、菌絲和子囊殼等特征,判斷真菌的屬性,如果不能確定,取出載玻片在酒精燈上消毒,滴加一滴乳酸苯酚固定液,接種針在酒精燈上消毒,然后在無(wú)菌的培養(yǎng)基中冷卻一下,蘸取一點(diǎn)菌體涂在固定液上,蓋上蓋玻片,防止氣泡,置于低倍鏡和高倍鏡下觀察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形態(tài)特征,重點(diǎn)觀察菌絲是否分隔,曲霉和青霉的分生孢子形成特點(diǎn),對(duì)根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子進(jìn)行鑒定,繪圖。檢驗(yàn)用過(guò)的平板也要經(jīng)高壓滅菌后再行處理,防止交叉感染。5培養(yǎng)基的使用(1)選擇正確的滅菌消毒方法及規(guī)范的操作是糧食真菌檢驗(yàn)的關(guān)鍵,按上述控制方法進(jìn)行操作可以達(dá)到良好的無(wú)菌效果。(2)高溫干熱滅菌時(shí),電烘箱內(nèi)物品不要擺得太擠,以免妨礙空氣流通,滅菌物品不要接觸電烘箱內(nèi)壁的鐵板,滅菌溫度不能超過(guò)180℃,以防包裝紙烤焦起火。在保持160℃,2h恒溫時(shí),嚴(yán)防恒溫調(diào)節(jié)自動(dòng)控制失靈而造成安全事故。待溫度下降到70℃后再取出物品。如出現(xiàn)冒煙現(xiàn)象,切忌打開(kāi)烘箱門(mén),避免燃燒。(3)培養(yǎng)基三角瓶分裝,