地衣芽孢桿菌s-菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

地衣芽孢桿菌s-菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

0芽孢桿菌的應(yīng)用[研究意義]是指促進(jìn)腸內(nèi)菌群生態(tài)平衡，對(duì)主枝有用的微生物。在畜禽養(yǎng)殖中使用益生菌不僅可避免長期使用抗生素引起的腸道微生態(tài)平衡的破壞、耐藥菌株的產(chǎn)生及藥物殘留等問題,而且還具有提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和免疫力,對(duì)動(dòng)物無毒無害及畜產(chǎn)品中無殘留等特點(diǎn)。1989年美國食品與藥物管理局(FDA)公布了42種可直接用于畜禽生產(chǎn)的微生物,應(yīng)用較多的為乳酸桿菌、糞鏈球菌、酵母菌、芽孢桿菌。從動(dòng)物生產(chǎn)和飼料工業(yè)特點(diǎn)看,芽孢桿菌比其他有益微生物有更多的優(yōu)點(diǎn),因而其研究和應(yīng)用受到廣泛重視。【前人研究進(jìn)展】目前枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌應(yīng)用較多。由地衣芽孢桿菌制備而成的微生態(tài)制劑具有如下優(yōu)良特性:(1)能調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群平衡,改善腸道微生態(tài)環(huán)境,促進(jìn)動(dòng)物生長和提高抗病力。(2)在不利環(huán)境條件下能以孢子形式存在,在飼料制粒、貯存及胃酸環(huán)境中仍能保持高活性。(3)能刺激動(dòng)物免疫器官的生長發(fā)育,激活淋巴細(xì)胞,提高免疫球蛋白和抗體水平,增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能,提高機(jī)體免疫力。(4)能自身合成消化性酶類,如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶等,與內(nèi)源消化酶共同發(fā)揮作用,促進(jìn)養(yǎng)分的消化吸收?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株發(fā)酵培養(yǎng)基組分及優(yōu)化條件尚不確定?！緮M解決關(guān)鍵問題】以自行分離篩選的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)TS-Ⅱ菌株為研究對(duì)象,對(duì)其搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。為其規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)提供依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1材料表面菌種為新疆天山北坡牧場中分離篩選的地衣芽抱桿菌(Bacilluslichenlformis)TS-Ⅱ菌株。1.1.2培養(yǎng)基1.1.2.溫滅菌、冷卻蛋白胨10g,NaCl10g,酵母粉5g,水1000mL,不調(diào)節(jié)pH值,121℃高溫滅菌25min?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基):葡萄糖10g、(NH4)2HPO44g、NaCl5g、K2HPO42g、MgSO41g、CaCl20.4g、FeSO40.02g、MnSO40.01g,水1000mL,調(diào)pH至7.0,121℃高溫滅菌25min。1.1.2.2.表面活性劑蛋白胨10g,NaCl10g,酵母粉5g,瓊脂15g,水1000mL,調(diào)pH至6.0,121℃高溫滅菌25min。1.2方法1.2.1細(xì)菌激活將已保存的地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌種活化后轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24h,備用。1.2.2種子溶液的制備取一環(huán)活化菌種,接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,37℃,180r/min培養(yǎng)18h。1.2.3養(yǎng)基、三角瓶的接種量分別取1mL種子液,接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中(接種量為2%,V/V)。置37℃搖床中振蕩培養(yǎng),轉(zhuǎn)速為200r/min,進(jìn)行單因素和正交實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵條件研究。1.2.4單因素培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)1.2.4.碳源和建立碳源培養(yǎng)基分別用1%(葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油)替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源制成培養(yǎng)基。采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件,12h后測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量,以確定最佳碳源。1.2.4.無機(jī)碳源的替代分別用1%(蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、胰蛋白胨、尿素、(NH4)2SO4、NH4NO3、(NH4)2HPO4、玉米漿、尿素)替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的無機(jī)碳源。采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件,12h后測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量,以確定最佳氮源。1.2.4.無機(jī)對(duì)ts-菌株生長的影響鑒于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中含有多種無機(jī)鹽,為研究其對(duì)于TS-Ⅱ菌株生長的影響,分別用濃度為0.2%NaCl、K2HPO4、MgSO4、CaCl2、FeSO4、MnSO4及不加無機(jī)鹽的空白,與上述實(shí)驗(yàn)所確定的最佳碳氮源配比,采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件,12h后測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量,以確定各種無機(jī)鹽對(duì)于TS-Ⅱ菌株生長的影響。1.2.4.碳源濃度對(duì)發(fā)酵的影響在確定上述最佳氮源和無機(jī)鹽濃度不變的情況下,最佳碳源濃度分別為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%,采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件,12h后測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量,以確定最佳碳源濃度。1.2.4.最佳氮源濃度確定在確定上述最佳碳源和無機(jī)鹽濃度不變的情況下,最佳氮源濃度分別為0.5%、2%、4%、6%、8%、10%,采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件,12h后測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量,以確定最佳氮源濃度。1.2.4.無機(jī)鹽濃度對(duì)酵母菌生長的影響在確定上述最佳碳氮源濃度不變的情況下,選取對(duì)TS-Ⅱ菌株生長有顯著影響的無機(jī)鹽,濃度分別為0.5%、2%、4%、6%、8%、10%,采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件,12h后測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量,以確定最佳無機(jī)鹽濃度。1.2.5正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果將篩選出的最佳的碳源、氮源和無機(jī)鹽3個(gè)重要因素,在分別確定的最佳濃度左右浮動(dòng)作為3個(gè)水平,選用3因素3水平L9(33)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以做進(jìn)一步優(yōu)化,采用正交軟件助手對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。表1,表21.2.6培養(yǎng)基的制備取1mL培養(yǎng)好的種子液接種于盛有50mL最優(yōu)化培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件振蕩培養(yǎng)24h,自接種后每2h取樣1次測(cè)定菌液的OD值(600nm),用未接種培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。1.2.7發(fā)酵條件優(yōu)化采用最適培養(yǎng)基配方,固定搖瓶培養(yǎng)的其他發(fā)酵條件后,對(duì)初始pH、溫度、裝液量及接種量進(jìn)行逐一優(yōu)化。1.2.7.初始ph值的確定在最優(yōu)培養(yǎng)基的條件下以2mol/LHCl或3mol/LNaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,接種量2%(V/V),37℃搖床中振蕩培養(yǎng)12h,轉(zhuǎn)速為200r/min,取樣測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量,確定最適初始pH值。1.2.7.培養(yǎng)溫度的確定在最優(yōu)培養(yǎng)基,最適初始pH值的條件下,分別在30、35、40、45、50和55℃搖床中振蕩培養(yǎng)12h,轉(zhuǎn)速為200r/min,接種量2%(V/V),取樣測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量,確定最適培養(yǎng)溫度。1.2.7.裝液量的確定最適初始pH值和最適溫度的條件下,在250mL的三角瓶分別裝入10、20、30、40、50和60mL的最優(yōu)培養(yǎng)基,接種量2%(V/V),轉(zhuǎn)速為200r/min,培養(yǎng)12h后取樣測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量,確定最適裝液量。1.2.7.接種量的確定最適初始pH值和最適溫度的條件下,在250mL的三角瓶分別裝入最適裝液量的最優(yōu)培養(yǎng)基,接種量分別為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%,轉(zhuǎn)速200r/min,培養(yǎng)12h后取樣測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量,確定最適接種量。1.2.8測(cè)量活菌總數(shù)測(cè)定采用稀釋平板計(jì)數(shù)法;菌體生長曲線的測(cè)定采用比濁法,測(cè)定菌液的OD(600nm);pH測(cè)定儀測(cè)定菌液pH。2結(jié)果與分析2.1發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化2.1.1發(fā)酵液中活菌測(cè)定分別以1%葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油作為碳源,其他組分均相同進(jìn)行發(fā)酵。用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量。確定最佳碳源后,分別以不同濃度,其他組分均相同的條件進(jìn)行發(fā)酵,測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量。葡萄糖、蔗糖和甘油為碳源時(shí)地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株的生長明顯優(yōu)于可溶性淀粉、乳糖和果糖,利用前三種培養(yǎng)基發(fā)酵后,該菌活菌數(shù)超過2.0×1010CFU/mL。而利用乳糖發(fā)酵后其活菌數(shù)在0.5×1010CFU/mL以下,說明地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株不能利用乳糖發(fā)酵,利用葡萄糖和蔗糖的能力優(yōu)于果糖。該菌生長的最佳碳源是蔗糖,其次是葡萄糖。蔗糖濃度在6%時(shí),地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株生長最佳,活菌數(shù)達(dá)到2.52×1010CFU/mL。圖1,圖22.1.2發(fā)酵液中活菌含量的測(cè)定以6%蔗糖為碳源,分別以1%蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、胰蛋白胨、尿素、(NH4)2SO4、NH4NO3、(NH4)2HPO4、玉米漿、尿素為氮源,其他組分均相同進(jìn)行發(fā)酵。用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量。確定最佳氮源后,分別以不同濃度,其他組分均相同的條件進(jìn)行發(fā)酵,測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量。氮源為有機(jī)氮源時(shí)地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株的生長明顯優(yōu)于無機(jī)氮源。利用有機(jī)氮源發(fā)酵后,該菌活菌數(shù)都超過2.5×1010CFU/mL,而利用無機(jī)氮源時(shí)的活菌數(shù)在1.0×1010CFU/mL以下,說明地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株利用有機(jī)氮源的能力優(yōu)于利用無機(jī)氮源。該菌生長的最適氮源是蛋白胨,這與蛋白胨富含氨基酸、維生素及生長因子有關(guān)。蛋白胨濃度在4%時(shí),地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株生長最佳,活菌數(shù)達(dá)到3.63×1010CFU/mL。圖3,圖42.1.3發(fā)酵條件對(duì)地衣芽孢桿菌ts-活菌的影響分別以6%蔗糖和4%蛋白胨為碳源和氮源,以不加無機(jī)鹽為空白,在此基礎(chǔ)上分別加入0.2%NaCl、K2HPO4、MgSO4、CaCl2、FeSO4、MnSO4進(jìn)行發(fā)酵,用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量。選取影響最為顯著的無機(jī)鹽,分別以不同濃度,其他組分均相同的條件進(jìn)行發(fā)酵,測(cè)定發(fā)酵液中的活菌含量。NaCl、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、MnSO4均高于對(duì)照組,說明NaCl、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、MnSO4對(duì)地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株的生長有促進(jìn)作用,其中活菌數(shù)最高的為NaCl,達(dá)到2.85×1010CFU/mL,而CaCl2發(fā)酵后的活菌數(shù)值低于對(duì)照組,說明CaCl2不能促進(jìn)地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株的生長。NaCl濃度在4%以下時(shí),地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株的活菌數(shù)隨濃度的升高而增大,NaCl濃度達(dá)到4%時(shí),地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株生長最佳,活菌數(shù)達(dá)到3.96×1010CFU/mL,NaCl濃度高于4%時(shí),該菌的活菌數(shù)隨濃度的升高迅速降低,說明較高的Na+濃度會(huì)抑制地衣芽孢桿菌的生長。圖5,圖62.1.4培養(yǎng)基配方優(yōu)化培養(yǎng)基中各組分之間有一定的內(nèi)在關(guān)系,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交實(shí)驗(yàn)以尋求培養(yǎng)基中各組分的最佳配比。實(shí)驗(yàn)條件下優(yōu)化水平的最佳組合為A2B1C2。即地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株的最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖6%、蛋白胨3%和NaCl3%。極差分析可知,RB>RA>RC,各因子對(duì)活菌數(shù)含量影響大小為蛋白胨>蔗糖>NaCl。表1,表22.2生長穩(wěn)定期期發(fā)酵培養(yǎng)0~2h為地衣芽孢桿菌的生長停滯期,細(xì)菌數(shù)量極少;自2h以后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,菌體數(shù)量急劇增多;在12h達(dá)到生長高峰期,10~12h為地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株生長的穩(wěn)定期,菌體生長緩慢。自12h后細(xì)菌數(shù)量開始減少,地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株進(jìn)入生長衰亡期。因此,采用10~12h時(shí)的菌液作為菌種較合適,此時(shí)地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株為對(duì)數(shù)生長末期,既可保持高的細(xì)胞活力,又可獲得盡可能多的細(xì)胞數(shù)。圖72.3發(fā)酵條件優(yōu)化2.3.1培養(yǎng)初始ph的確定pH值主要通過影響菌體細(xì)胞膜電荷、膜滲透性及營養(yǎng)物質(zhì)離子化程度,從而影響菌體對(duì)養(yǎng)分的吸收。由于搖瓶發(fā)酵過程中的pH難以控制,只能控制發(fā)酵液的初始pH。因此,實(shí)驗(yàn)在配制了最佳培養(yǎng)基后,將初始pH分別調(diào)至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12h,用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)其活菌數(shù)。在初始pH5~7地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株均可良好生長,pH為5.5時(shí)生長最好,但隨pH的增大,活菌數(shù)呈下降趨勢(shì),說明地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株適宜在酸性環(huán)境中生長。圖82.3.2酶活性的影響溫度主要通過改變酶反應(yīng)速率來影響菌體的生長。一般培養(yǎng)基溫度升高,酶反應(yīng)速率增大,生長代謝加快,生產(chǎn)期提前。但酶很容易因過熱而失去活性,表現(xiàn)為菌體容易衰老,影響最終產(chǎn)量。選取30、35、40、45、50和55℃作為搖床溫度分別測(cè)定不同溫度對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)的影響,在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12h,用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)其活菌數(shù)。由地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株在35~45℃均可良好生長,其生長的最適溫度為35℃。圖92.3.4發(fā)酵液活菌數(shù)測(cè)定分別選取0.5%、1%、2%、3%、4%、5%接種量,測(cè)定不同接種量對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)的影響,在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12h,用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)其活菌數(shù)。地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株生長的最適接種量為0.5%,隨接種量的增大,地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株的活菌數(shù)減小。圖113khpo42、meso40、mnso40的mnso40的mnso-40.3采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析對(duì)地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行的優(yōu)化,確定TS-Ⅱ菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分為(g/L):蔗糖60、蛋白胨30、NaCl30、K2HPO42、MgSO41、FeSO40.02、MnSO40.01。對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)初始pH值、培養(yǎng)溫度和裝液量是影響TS-Ⅱ菌株發(fā)酵生產(chǎn)水平的重要因素,發(fā)酵的最適初始pH值為5.5,最適培養(yǎng)溫度為35℃,最適裝液量為10mL(250mL)三角瓶,通過優(yōu)化培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件,使地衣芽孢桿菌TS-Ⅱ菌株活菌數(shù)顯著提高,達(dá)到了