蜘蛛香總黃酮對h22小鼠抗腫瘤作用及對cancil的影響

蜘蛛香總黃酮對h22小鼠抗腫瘤作用及對cancil的影響

肝癌是世界上最常見的腫瘤之一，其惡性程度高，發(fā)展迅速，預(yù)后差，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生活。蜘蛛香總黃酮系敗醬科(Valerianaceae)纈草屬(ValerianaLinn.)植物蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)的根莖和根,課題組前期研究發(fā)現(xiàn),蜘蛛香總黃酮提取物對體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞具有明顯的抑制增殖和抗轉(zhuǎn)移作用。本研究通過建立荷H22小鼠模型,進(jìn)一步考察了其體內(nèi)抗肝癌作用,應(yīng)用小鼠全基因組基因芯片對pathwaysincancer的變化進(jìn)行了考察,從而在信號通路水平研究其抗腫瘤作用機(jī)制。1材料表面1.1動物1.2腫瘤植株小鼠肝癌H22瘤株,由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心免疫實驗室提供。2方法2.1動物模型的制備2.2dna的純化、純化及分析。式中,C為模型組平均瘤重(g),T為給藥組平均瘤重(g)。②基因表達(dá)譜芯片檢測:股動脈取血后處死小鼠,解剖取出腫瘤,迅速放入液氮罐凍存。采用Trizol(Invitrogen公司)一步法提取小鼠腫瘤的總RNA,RNeasyminikit(Qiagen公司)純化RNA,用瓊脂糖凝膠電泳對樣品總RNA進(jìn)行定量、質(zhì)檢。實驗標(biāo)記方法采用Agilent放大標(biāo)記方法,各取適量探針進(jìn)行雜交,雜交方法采用65℃,17h滾動雜交,并在室溫洗片。芯片結(jié)果采用Agilent掃描儀進(jìn)行掃描(Scanresolution:5μm;PMT:100%,10%),AgilentFeatureExtraction軟件讀取數(shù)據(jù)。最后采用FeatureExtraction進(jìn)行Normalize處理分析。通過AgilentGeneSpringGXsoftware軟件處理得到基因表達(dá)變化的倍數(shù)。差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為比值>2為表達(dá)上調(diào)基因,比值<0.5為表達(dá)下調(diào)基因(數(shù)據(jù)小于0.5時取倒數(shù))。通過KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫,查詢各用藥組與模型對照組相比表達(dá)差異基因所參與的pathwaysincancer變化情況。3結(jié)果3.1肝癌抑制作用3.2各組遺傳因素的差異3.3各組遺傳因素的差異3.4遺傳因素的差異是對遺傳因素的分析4tfr、igf1和pi3k-akt1的結(jié)構(gòu)及表達(dá)我們在前期體內(nèi)抗H22活性的基礎(chǔ)上,運用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)對蜘蛛香總黃酮抑制小鼠H22的差異表達(dá)基因進(jìn)行初步篩選,以期從基因水平闡釋出蜘蛛香總黃酮抗H22肝癌的機(jī)制。通過對差異表達(dá)基因的分析,發(fā)現(xiàn)下調(diào)的基因在pathwaysincancer通路中都起到對腫瘤促進(jìn)作用,參與血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移等多個方面。研究發(fā)現(xiàn)Epas1、Pdgfra均能通過誘導(dǎo)Vegf的表達(dá)促進(jìn)血管的生成,下調(diào)Epas1、Pdgfra、Vegfc、Figf能抑制血管生成,從而阻止腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。Csf1r的過量表達(dá)與肝癌細(xì)胞的生長、分化及轉(zhuǎn)化密切相關(guān),可能是c-fms原癌基因發(fā)生點突變導(dǎo)致Csf1r表達(dá)量增加,后者通過自分泌生長方式促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)化。同時,Pdgfra、Vegfc、Figf、Csf1r、Igf1又能通過PI3K-AKT途徑促進(jìn)腫瘤生成、侵襲和轉(zhuǎn)移。Pik3r1是一類特異的催化磷脂酰肌醇脂物質(zhì)的激酶,由其活化而產(chǎn)生的類脂產(chǎn)物PIP2和PIP3作為第二信使結(jié)合并激活多種細(xì)胞內(nèi)靶蛋白,形成一個信號級聯(lián)復(fù)合物,最終調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、存活和遷移,通過下調(diào)Pdgfra、Vegfc、Figf、Csf1r、Igf1、Pik3r1、Prkcb而抑制了PI3K-AKT途徑。Fzd9Frizzle基因家族的成員編碼了一個7次跨細(xì)胞膜的跨膜蛋白,這個蛋白是Wnt信號通路的組成成員,并在其中發(fā)揮了重要的作用。Wnt途徑的異?；罨诩?xì)胞癌變、腫瘤發(fā)生及腫瘤侵襲過程中具有重要的作用。當(dāng)基因本身或通路其他任一成員因素發(fā)生變化使其不正?；罨瘯r,均有可能引起腫瘤,其中FZD受體的異常表達(dá)可見于多種惡性腫瘤。Tcf7l1、Tcf7l2、Fzd9、Prkcb參與Wnt信號傳導(dǎo)通路,與腫瘤細(xì)胞增殖和分化相關(guān)。下調(diào)這些基因,能從Wnt途徑對腫瘤起到抑制作用。CyclinE是細(xì)胞周期蛋白中的一種,它可與CDk2結(jié)合形成復(fù)合物,磷酸化其底物,釋放轉(zhuǎn)錄因了E2F,啟動DNA復(fù)制,使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期,是G1/S期轉(zhuǎn)換的主要限速因子,P15(CDKN2B)在TGFβ介導(dǎo)的生長抑制中起重要作用。TGFβ誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯在G1期,起源于P15轉(zhuǎn)錄量的增加,后者可與cyclinD/cdk4、cyclinD/cdk6復(fù)合體結(jié)合,取代復(fù)合體中的P27,使P27結(jié)合并抑制cyclinE/cdk2復(fù)合體。TGFβ抑制生長的作用歸因與上述兩種cyclin/cdk復(fù)合體的共同抑制。Myc基因是人類腫瘤中最常見的高表達(dá)的癌基因之一,它在肝癌中呈高表達(dá),涉及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中許多方面,如細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。各種模式證實,c-myc的過度表達(dá)能導(dǎo)致細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡都增加,從而使腫瘤的絕對細(xì)胞數(shù)沒有凈增加。同時,我們發(fā)現(xiàn)Ctbp2、Mmp1a、Vegfa出現(xiàn)了上調(diào),這3個基因分別涉及促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、降解多種細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分和促血管生成,這說明蜘蛛香總黃酮抑制腫瘤作用的復(fù)雜性有待于我們的下一步深入探討?？傊?蜘蛛香總黃酮可以通過下調(diào)多種功能基因從腫瘤細(xì)胞凋亡、增殖和遷移等多個方面發(fā)揮抗腫瘤作用。其抗腫瘤作用是多個靶基因共同作用的結(jié)果,尚需使用功能分類基因芯片對表達(dá)譜芯片進(jìn)行進(jìn)一步研究。昆明種小鼠,體重18~22g,雌雄各半,由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供,合格證號:SCXK(川)2008-24。1.3齊魯制藥有限公司蜘蛛香,購于成都市荷花池藥材市場;替加氟,齊魯制藥有限公司,批號910006LD;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na),成都市科龍化工試劑廠,批號20090929。1.4儀器與檢測方法Agilent小鼠全基因4*44K芯片,美國Roche-Nimblegen公司;PTC-100PCR儀,美國MJ公司;G2545A雜交爐,美國Agilent公司;G2565BA掃描儀,美國Agilent公司;ND1000分光光度計,美國Nanodrop公司。無菌操作條件下取荷肝癌H22小鼠腹水,生理鹽水稀釋至腫瘤細(xì)胞濃度為1×107·mL-1,于每只小鼠左腋皮下接種0.2mL。蜘蛛香總黃酮:采用超聲提取法從蜘蛛香干燥粉末中提取,并用HPD600大孔樹脂進(jìn)行純化,得到的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.20%。將上述制得的蜘蛛香總黃酮用0.5%CMC-Na分別配成高、低兩個劑量,密封,置4℃冰箱中冷藏備用。替加氟溶液:用0.5%CMC-Na將替加氟片配成濃度10mg·mL-1的溶液,密封,置4℃冰箱中冷藏備用。2.3mt-na的制備接種第二天,將小鼠稱重并隨機(jī)分為4組,每組10只,雌雄各半。模型對照組:灌胃0.5%CMC-Na,20mL·kg-1;陽性對照組:灌胃替加氟溶液,200mg·kg-1;蜘蛛香總黃酮高、低劑量組:灌胃蜘蛛香總黃酮提取物溶液,劑量分別為生藥450mg·kg-1、150mg·kg-1。每日按0.2mL·10g-1標(biāo)準(zhǔn)定時灌胃給藥1次,連續(xù)給藥10d。2.4兩組患者施工前后ph、nb、csf1和vegf1的基因表達(dá)比較①瘤重和抑瘤率:給藥結(jié)束次日,將動物股動脈取血后處死,小心剝離出皮下腫瘤塊并稱重,按下式計算出腫瘤抑制百分率。陽性對照組、蜘蛛香總黃酮高、低劑量組的平均瘤重明顯降低,與模型對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05),各組的抑瘤率分別為45.32%、30.06%、25.97%,見表1。運用KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫,查詢各用藥組與模型對照組相比表達(dá)差異基因所參與的pathwaysincancer變化情況,發(fā)現(xiàn)陽性對照組、蜘蛛香總黃酮高劑量組和低劑量組與模型對照組相比,pathwaysincancer中17個基因的表達(dá)同時發(fā)生了顯著性變化,其中6個明顯上調(diào),11個明顯下調(diào),見表2。相對于模型對照組,陽性對照組、