高效液相色譜法同時(shí)測定25批蜘蛛香中5種有效成分

高效液相色譜法同時(shí)測定25批蜘蛛香中5種有效成分

蜘蛛香是薔薇科植物的蜘蛛根和根莖。具有理氣、止痛、消食、除濕、鎮(zhèn)靜人心等功效。《中國藥典》(2010年版)規(guī)定蜘蛛香以其中的纈草三酯和乙酰纈草三酯作為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定。然而,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及課題組前期研究顯示,纈草素類成分并不非常穩(wěn)定,故可以選擇更為穩(wěn)定的成分作為含量測定指標(biāo)對藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。為了保證蜘蛛香的質(zhì)量,本實(shí)驗(yàn)在課題組對其化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上,選擇了含量較高、穩(wěn)定性較好且具有多種藥理活性的3-O-咖啡酰基奎寧酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡?；鼘幩嶙鳛橘|(zhì)量控制指標(biāo),建立以高效液相色譜法同時(shí)測定該3種活性成分含量的方法,并以統(tǒng)計(jì)分析軟件“TheUnscramblerX10.1”對25批蜘蛛香藥材的含量測定結(jié)果進(jìn)行聚類分析,旨在提升該藥材的質(zhì)量控制,并為其合理開發(fā)利用提供一定的實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。1儀器和試劑盒1.1柱溫箱、紫外分離器Agilent1100高效液相色譜儀(四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測器、Chemstation色譜工作站)(美國安捷倫公司);MettlerAE240電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);超純水機(jī)(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)等。1.2測定試劑及儀器3-O-咖啡?；鼘幩?、橙皮苷和4,5-O-二咖啡?；鼘幩釋φ掌?自制,HPLC峰面積歸一化法測定純度均大于98%),乙腈為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)所用25批貴州蜘蛛香藥材,均由貴陽醫(yī)學(xué)院龍慶德副教授鑒定均為敗醬草科纈草屬蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)的干燥根莖及根。2方法和結(jié)果2.1量表1:3-o-咖啡?；鼘幩崛芤荷V柱:PhenomenexGeminiC18(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫:0~16min,6%~20%A;16~21min,20%~23.5%A;21~30min,23.5%A;30~35min,23.5%~32%A;檢測波長:340nm;柱溫:25℃;流速:1.0mL·min-1;進(jìn)樣量:10μL。在此條件下,理論板數(shù)按3-O-咖啡?；鼘幩嵊?jì)應(yīng)不低于10000,供試品中3-O-咖啡?；鼘幩?、橙皮苷、4,5-O-二咖啡?；鼘幩岱蛛x度均大于1.5。對照品和供試品溶液的色譜圖,見圖1。2.2對照品溶液的制備稱取3-O-咖啡酰基奎寧酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸對照品適量,精密稱定,加體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液制成每1mL分別含3-O-咖啡?；鼘幩?.165mg,橙皮苷0.570mg,4,5-O-二咖啡?；鼘幩?.055mg的混合對照品溶液,即得。2.3提取減失液制備取蜘蛛香藥材粉末(過40目篩)約0.25g,精密稱定,精密加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇25mL,稱定重量,加熱回流提取1.5h,放冷,再稱定重量,用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,高速離心10min(10000r·min-1),取上清液,即得。2.4-o-咖啡?；鼘幩針?biāo)準(zhǔn)精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液2,4,6,8,10,12μL依次進(jìn)樣,按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)測定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X),計(jì)算回歸方程。3-O-咖啡酰基奎寧酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡?；鼘幩岬幕貧w方程分別為Y=2475.90X-23.85(r=0.9999)、Y=316.33X-16.93(r=0.9999)、Y=3243.82X-14.72(r=0.9999)。結(jié)果表明,3-O-咖啡酰基奎寧酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡?；鼘幩岱謩e在0.33~1.97μg、1.14~6.84μg、0.11~0.66μg呈良好的線性關(guān)系。2.5進(jìn)樣峰面積測定精密吸取按“2.3”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液10μL注入液相色譜儀,連續(xù)進(jìn)樣6次,測定峰面積。結(jié)果3-O-咖啡?；鼘幩?、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸峰面積的RSD分別為1.1%,1.8%,0.8%,表明在此條件下儀器精密度良好。2.6復(fù)配體系中各組分含量的rsd取同一批號蜘蛛香藥材粉末,按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)條件測定,并計(jì)算各成分含量的RSD。結(jié)果3-O-咖啡酰基奎寧酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量的RSD分別為0.8%,1.6%,1.2%,表明該方法的重復(fù)性良好。2.7進(jìn)樣測定條件精密吸取同一供試品溶液10μL,分別于0,1,2,4,8,12h進(jìn)樣,按“2.1”項(xiàng)條件測定。結(jié)果3-O-咖啡?；鼘幩?、橙皮苷和4,5-O-二咖啡?；鼘幩岱迕娣e的RSD分別為1.8%,0.9%,1.1%,說明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。2.8加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量(含3-O-咖啡酰基奎寧酸7.49mg·g-1、橙皮苷31.20mg·g-1、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸3.22mg·g-1)的同一批次藥材粉末6份,每份約0.125g,分別精密加入混合對照品溶液25mL(含3-O-咖啡?；鼘幩?.0375mg·mL-1、橙皮苷0.1560mg·mL-1、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸0.0161mg·mL-1),按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下條件測定含量,計(jì)算回收率及其RSD,結(jié)果見表1。3樣品測定分別取不同產(chǎn)地蜘蛛香藥材,按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備2份供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下條件測定,結(jié)果見表2。4聚類分析結(jié)果分別取不同產(chǎn)地(批次)蜘蛛香藥材的含量測定結(jié)果進(jìn)行聚類分析。以樣品中3種活性成分含量作為指標(biāo)進(jìn)行聚類分析,采用TheUnscramblerX10.1統(tǒng)計(jì)軟件的離差平方和法(Ward法),選取歐氏距離平方(squaredEuclideandistance)作為樣品測度,對25批樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,繪出樹狀圖,結(jié)果見圖2。根據(jù)聚類分析結(jié)果,在距離4內(nèi)可將25批樣品分為3類:第一類有10批藥材,即S3、S6~S7、S9、S12~S14、S19~S21,此類樣品中3-O-咖啡?；鼘幩岷枯^高,而橙皮苷含量偏低,導(dǎo)致此類樣品中3種被測成分總含量均低于平均值;第二類有10批藥材,即S1~S2、S4~S5、S8、S15、S22~S25,此類樣品中3種被測成分各含量較均衡,與平均值無較大差異;第三類有5批藥材,即S10~S11、S16~S18,此類樣品中被測3種成分的總含量較高,且橙皮苷含量遠(yuǎn)高于其他樣品,結(jié)果見表3。5檢測波長的選擇及提取方法的確定近年來,蜘蛛香的相關(guān)報(bào)道很多,但在其質(zhì)量控制方面卻仍不完善,纈草素類成分不耐熱、易酸水解,而采用文獻(xiàn)報(bào)道橙皮苷單一指標(biāo)的含量測定又不能完全反應(yīng)蜘蛛香的整體情況,這限制了蜘蛛香及其制劑的進(jìn)一步開發(fā)。故本實(shí)驗(yàn)在課題組前期對蜘蛛香化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上,選擇了其中較穩(wěn)定的3-O-咖啡酰基奎寧酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡?；鼘幩嶙鳛橹笜?biāo)成分,該3種成分具有抗炎、抗氧化、抗菌抗病毒等藥理活性,該含量測定方法能夠用于蜘蛛香藥材的質(zhì)量控制。實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測器檢測在190~400nm之間對待測成分進(jìn)行紫外掃描,結(jié)果在340nm進(jìn)樣測定時(shí),基線平穩(wěn)、分離較好且峰形對稱,故選擇340nm作為檢測波長。由于所測定的成分極性相差較大,故采用梯度洗脫,且結(jié)果表明,乙腈-水的分離效果比甲醇-水的分離效果好;而橙皮苷和奎寧酸類化合物均含有酚羥基,以有機(jī)溶劑-水為流動(dòng)相,色譜峰峰形不佳,故實(shí)驗(yàn)選用乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。實(shí)驗(yàn)對供試品的制備方法進(jìn)行了考察,比較了不同提取方式(回流提取2h、超聲提取30min、索式提取4h)、不同提取溶劑(甲醇、體積分?jǐn)?shù)70%甲醇、體積分?jǐn)?shù)50%甲醇、乙醇、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、體積分?jǐn)?shù)50%乙醇)以及不同提取時(shí)間(0.5、1、1.5、2、4、6h)。結(jié)果表明,采用回流提取方法,以體積分?jǐn)?shù)50%乙醇作為提取溶劑,提取1.5h,被測成分提取基本完全,且提取效率較高。本實(shí)驗(yàn)以3-O-咖啡?；鼘幩?、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸作為指標(biāo)成分對貴州地區(qū)蜘蛛香藥材進(jìn)行測定,其中3-O-咖啡?；鼘幩岷?,5-O-二咖啡酰基奎寧酸為課題組前期研究中首次分離得到的化合物,橙皮苷測定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基