高效液相色譜法同時測定25批蜘蛛香中5種有效成分

高效液相色譜法同時測定25批蜘蛛香中5種有效成分

蜘蛛香是薔薇科植物的蜘蛛根和根莖。具有理氣、止痛、消食、除濕、鎮(zhèn)靜人心等功效?！吨袊幍洹?2010年版)規(guī)定蜘蛛香以其中的纈草三酯和乙酰纈草三酯作為指標成分進行含量測定。然而,根據文獻報道及課題組前期研究顯示,纈草素類成分并不非常穩(wěn)定,故可以選擇更為穩(wěn)定的成分作為含量測定指標對藥材進行質量控制。為了保證蜘蛛香的質量,本實驗在課題組對其化學成分研究的基礎上,選擇了含量較高、穩(wěn)定性較好且具有多種藥理活性的3-O-咖啡?；鼘幩帷⒊绕ぼ蘸?,5-O-二咖啡?；鼘幩嶙鳛橘|量控制指標,建立以高效液相色譜法同時測定該3種活性成分含量的方法,并以統(tǒng)計分析軟件“TheUnscramblerX10.1”對25批蜘蛛香藥材的含量測定結果進行聚類分析,旨在提升該藥材的質量控制,并為其合理開發(fā)利用提供一定的實驗及理論依據。1儀器和試劑盒1.1柱溫箱、紫外分離器Agilent1100高效液相色譜儀(四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、Chemstation色譜工作站)(美國安捷倫公司);MettlerAE240電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);超純水機(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)等。1.2測定試劑及儀器3-O-咖啡?；鼘幩帷⒊绕ぼ蘸?,5-O-二咖啡?；鼘幩釋φ掌?自制,HPLC峰面積歸一化法測定純度均大于98%),乙腈為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。實驗所用25批貴州蜘蛛香藥材,均由貴陽醫(yī)學院龍慶德副教授鑒定均為敗醬草科纈草屬蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)的干燥根莖及根。2方法和結果2.1量表1:3-o-咖啡?；鼘幩崛芤荷V柱:PhenomenexGeminiC18(4.6mm×250mm,5μm);流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫:0~16min,6%~20%A;16~21min,20%~23.5%A;21~30min,23.5%A;30~35min,23.5%~32%A;檢測波長:340nm;柱溫:25℃;流速:1.0mL·min-1;進樣量:10μL。在此條件下,理論板數(shù)按3-O-咖啡酰基奎寧酸計應不低于10000,供試品中3-O-咖啡?；鼘幩?、橙皮苷、4,5-O-二咖啡?；鼘幩岱蛛x度均大于1.5。對照品和供試品溶液的色譜圖,見圖1。2.2對照品溶液的制備稱取3-O-咖啡?；鼘幩帷⒊绕ぼ蘸?,5-O-二咖啡?；鼘幩釋φ掌愤m量,精密稱定,加體積分數(shù)50%乙醇溶液制成每1mL分別含3-O-咖啡?；鼘幩?.165mg,橙皮苷0.570mg,4,5-O-二咖啡?；鼘幩?.055mg的混合對照品溶液,即得。2.3提取減失液制備取蜘蛛香藥材粉末(過40目篩)約0.25g,精密稱定,精密加入體積分數(shù)50%乙醇25mL,稱定重量,加熱回流提取1.5h,放冷,再稱定重量,用體積分數(shù)50%乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,高速離心10min(10000r·min-1),取上清液,即得。2.4-o-咖啡?；鼘幩針藴示芪　?.2”項下混合對照品溶液2,4,6,8,10,12μL依次進樣,按“2.1”項下條件進測定。以峰面積為縱坐標(Y),進樣量(μg)為橫坐標(X),計算回歸方程。3-O-咖啡?；鼘幩帷⒊绕ぼ蘸?,5-O-二咖啡?；鼘幩岬幕貧w方程分別為Y=2475.90X-23.85(r=0.9999)、Y=316.33X-16.93(r=0.9999)、Y=3243.82X-14.72(r=0.9999)。結果表明,3-O-咖啡?；鼘幩?、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸分別在0.33~1.97μg、1.14~6.84μg、0.11~0.66μg呈良好的線性關系。2.5進樣峰面積測定精密吸取按“2.3”項下方法制備的供試品溶液10μL注入液相色譜儀,連續(xù)進樣6次,測定峰面積。結果3-O-咖啡酰基奎寧酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡?；鼘幩岱迕娣e的RSD分別為1.1%,1.8%,0.8%,表明在此條件下儀器精密度良好。2.6復配體系中各組分含量的rsd取同一批號蜘蛛香藥材粉末,按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項條件測定,并計算各成分含量的RSD。結果3-O-咖啡?；鼘幩?、橙皮苷和4,5-O-二咖啡?；鼘幩岷康腞SD分別為0.8%,1.6%,1.2%,表明該方法的重復性良好。2.7進樣測定條件精密吸取同一供試品溶液10μL,分別于0,1,2,4,8,12h進樣,按“2.1”項條件測定。結果3-O-咖啡?；鼘幩?、橙皮苷和4,5-O-二咖啡?；鼘幩岱迕娣e的RSD分別為1.8%,0.9%,1.1%,說明供試品溶液在12h內穩(wěn)定。2.8加樣回收率試驗精密稱取已知含量(含3-O-咖啡?；鼘幩?.49mg·g-1、橙皮苷31.20mg·g-1、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸3.22mg·g-1)的同一批次藥材粉末6份,每份約0.125g,分別精密加入混合對照品溶液25mL(含3-O-咖啡?；鼘幩?.0375mg·mL-1、橙皮苷0.1560mg·mL-1、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸0.0161mg·mL-1),按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下條件測定含量,計算回收率及其RSD,結果見表1。3樣品測定分別取不同產地蜘蛛香藥材,按“2.3”項下方法平行制備2份供試品溶液,按“2.1”項下條件測定,結果見表2。4聚類分析結果分別取不同產地(批次)蜘蛛香藥材的含量測定結果進行聚類分析。以樣品中3種活性成分含量作為指標進行聚類分析,采用TheUnscramblerX10.1統(tǒng)計軟件的離差平方和法(Ward法),選取歐氏距離平方(squaredEuclideandistance)作為樣品測度,對25批樣品進行系統(tǒng)聚類分析,繪出樹狀圖,結果見圖2。根據聚類分析結果,在距離4內可將25批樣品分為3類:第一類有10批藥材,即S3、S6~S7、S9、S12~S14、S19~S21,此類樣品中3-O-咖啡?；鼘幩岷枯^高,而橙皮苷含量偏低,導致此類樣品中3種被測成分總含量均低于平均值;第二類有10批藥材,即S1~S2、S4~S5、S8、S15、S22~S25,此類樣品中3種被測成分各含量較均衡,與平均值無較大差異;第三類有5批藥材,即S10~S11、S16~S18,此類樣品中被測3種成分的總含量較高,且橙皮苷含量遠高于其他樣品,結果見表3。5檢測波長的選擇及提取方法的確定近年來,蜘蛛香的相關報道很多,但在其質量控制方面卻仍不完善,纈草素類成分不耐熱、易酸水解,而采用文獻報道橙皮苷單一指標的含量測定又不能完全反應蜘蛛香的整體情況,這限制了蜘蛛香及其制劑的進一步開發(fā)。故本實驗在課題組前期對蜘蛛香化學成分研究的基礎上,選擇了其中較穩(wěn)定的3-O-咖啡?；鼘幩?、橙皮苷和4,5-O-二咖啡?；鼘幩嶙鳛橹笜顺煞?該3種成分具有抗炎、抗氧化、抗菌抗病毒等藥理活性,該含量測定方法能夠用于蜘蛛香藥材的質量控制。實驗采用二極管陣列檢測器檢測在190~400nm之間對待測成分進行紫外掃描,結果在340nm進樣測定時,基線平穩(wěn)、分離較好且峰形對稱,故選擇340nm作為檢測波長。由于所測定的成分極性相差較大,故采用梯度洗脫,且結果表明,乙腈-水的分離效果比甲醇-水的分離效果好;而橙皮苷和奎寧酸類化合物均含有酚羥基,以有機溶劑-水為流動相,色譜峰峰形不佳,故實驗選用乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫。實驗對供試品的制備方法進行了考察,比較了不同提取方式(回流提取2h、超聲提取30min、索式提取4h)、不同提取溶劑(甲醇、體積分數(shù)70%甲醇、體積分數(shù)50%甲醇、乙醇、體積分數(shù)70%乙醇、體積分數(shù)50%乙醇)以及不同提取時間(0.5、1、1.5、2、4、6h)。結果表明,采用回流提取方法,以體積分數(shù)50%乙醇作為提取溶劑,提取1.5h,被測成分提取基本完全,且提取效率較高。本實驗以3-O-咖啡?；鼘幩?、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸作為指標成分對貴州地區(qū)蜘蛛香藥材進行測定,其中3-O-咖啡?；鼘幩岷?,5-O-二咖啡酰基奎寧酸為課題組前期研究中首次分離得到的化合物,橙皮苷測定結果與文獻報道基