第五章-植物細(xì)胞制藥

生物技術(shù)制藥第六章植物細(xì)胞制藥第六章植物細(xì)胞工程制藥第一節(jié)基本概念第二節(jié)植物細(xì)胞工程發(fā)展簡史第三節(jié)植物細(xì)胞的形態(tài)和生理特性第四節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)第五節(jié)影響植物次級代謝產(chǎn)物累積的因素第六節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器第七節(jié)進(jìn)展與展望植物細(xì)胞工程定義：以植物細(xì)胞為基本單位，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，在離體條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為的精細(xì)操作，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而改良品種、制造新品種、加速繁育植物個(gè)體或獲得有用物質(zhì)的一門科學(xué)或技術(shù)稱為植物細(xì)胞工程。上游工程，下游工程。第一節(jié)基本概念高等植物次級代謝產(chǎn)物極其豐富多樣，除藥用之外，許多次級代謝產(chǎn)物還是食品、化工和農(nóng)業(yè)化學(xué)的重要原料。人們通過研究，一方面通過化學(xué)合成的方法來生產(chǎn)，另一方面通過植物細(xì)胞培養(yǎng)方法來生產(chǎn)。目前已經(jīng)研究過的近300種植物細(xì)胞培養(yǎng)物可以生產(chǎn)400多種人們感興趣的成分。一、基本概念1、植物細(xì)胞的全能性植物體中任何一個(gè)具有完整細(xì)胞核的細(xì)胞，在一定條件下都可以重新再分化形成原來的個(gè)體。（單個(gè)胡蘿卜體細(xì)胞可以直接形成體細(xì)胞胚并發(fā)育成完整的植株）2、植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)是指在無菌和人工控制的營養(yǎng)（培養(yǎng)基）及環(huán)境條件（光照、溫度等）下，研究植物的細(xì)胞、組織和器官以及控制其生長發(fā)育的技術(shù)。植物無菌培養(yǎng)技術(shù)分如下幾類：①幼苗及較大植株的培養(yǎng)，即為植物培養(yǎng)（plantculture）；②從植物各種器官的外植體增殖而形成的愈傷組織的培養(yǎng)叫做“愈傷組織培養(yǎng)”（callusculture）；③能夠保持較好分散性的離體細(xì)胞或較小細(xì)胞團(tuán)的液體培養(yǎng)，稱為“懸浮培養(yǎng)”（suspensionculture）；④離體器官的培養(yǎng)，如莖尖、根尖、葉片、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟果實(shí)的培養(yǎng)，稱為“器官培養(yǎng)”（organculture）；⑤未成熟或成熟的胚胎的離體培養(yǎng)，則稱為“胚胎培養(yǎng)”（embryoculture）。2、植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)3、植物的分化高等植物的分化可以分為胚胎發(fā)生和器官發(fā)生兩個(gè)階段。前者是從精子與卵細(xì)胞結(jié)合開始，分化為幼胚，進(jìn)而發(fā)育成成熟胚和種子。種子在適宜的條件下萌發(fā)，通過器官分化過程，形成根、莖、葉、花和果實(shí)。4、脫分化已經(jīng)分化的細(xì)胞、組織和器官在人工培養(yǎng)的條件下又變成未分化的細(xì)胞和組織的過程。5、再分化通過脫分化誘導(dǎo)形成的愈傷組織在適宜的培養(yǎng)條件下可再分化成為胚狀體或直接分化出器官。兩個(gè)途徑：由體細(xì)胞或性細(xì)胞，通過脫分化形成胚狀體；通過愈傷組織直接形成胚狀體。6、愈傷組織Callus：由母體外植體組織的增生細(xì)胞產(chǎn)生的不定型的疏松排列的薄壁細(xì)胞，愈傷組織培養(yǎng)中一般無明顯的組織或器官上的分化。7、懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)是指在液體培養(yǎng)基中，能夠保持良好分散性的細(xì)胞和小的細(xì)胞聚集體的培養(yǎng)。在此培養(yǎng)條件下組織化水平較低。8、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是指利用單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行液體或固體培養(yǎng)，誘導(dǎo)其增殖及分化。其目的是為了得到單細(xì)胞無性繁殖系。9、分生組織培養(yǎng)分生組織培養(yǎng)（meristemculture）又稱生長錐培養(yǎng)，是指在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)莖端分生組織細(xì)胞。分生組織，如莖尖分生組織的部位僅限于頂端圓錐區(qū)，其長度不超過0.1mm。研究表明，通過組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行植物的快速繁殖試驗(yàn)時(shí)往往并沒有利用這么小的外植體，而是利用較大的莖尖組織，通常包括1~2個(gè)葉原基。10、外植體外植體（explant）是指用于植物組織（細(xì)胞）培養(yǎng)的器官或組織（的切段），植物的各部位如根、莖、葉、花、果、穗、胚珠、胚乳、花藥和花粉等均可作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。11、器官形成器官形成（organogenesis）一般是指在組織培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)物中芽、根或花等器官的分化與形成。或者在先形成的小根基部迅速形成愈傷組織，然后再形成芽；或者在不同部位分別形成芽或根之后，再形成維管組織而將二者連成一個(gè)軸，最后形成小植株。12、無性繁殖系無性繁殖系（clone）又叫克隆，是指使用母體培養(yǎng)物反復(fù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，通過同種外植體而獲得越來越多的無性繁殖后代而言，如根無性系、組織無性系、懸浮培養(yǎng)物無性系等。在上述無性系的培養(yǎng)中，有時(shí)其局部的組織無論在結(jié)構(gòu)、生長速度以及顏色方面都表現(xiàn)出明顯的區(qū)別，如繼續(xù)進(jìn)行選擇培養(yǎng)，則從同一無性系可分離形成二個(gè)或多個(gè)不同的系列，該系列稱為“無性系的變異體”（clonalvariant）。13、突變體細(xì)胞本身發(fā)生遺傳變異或應(yīng)用誘變處理發(fā)生的遺傳變異所得的新細(xì)胞，即為突變體（mutant）。由單細(xì)胞形成的無性系稱為“單細(xì)胞無性系”；如果這種單細(xì)胞無性系是從同一組織分離得到的，并彼此不同時(shí)，叫做“單細(xì)胞變異體”。14、繼代培養(yǎng)由最初的外植體上切下的新增殖的組織，培養(yǎng)一代稱為“第一代培養(yǎng)”。連續(xù)多代的培養(yǎng)即為“繼代培養(yǎng)”（subculture），又稱“連續(xù)培養(yǎng)”。但習(xí)慣上“連續(xù)培養(yǎng)”一詞多用于不斷加入新的培養(yǎng)基，并連續(xù)收集培養(yǎng)物以保持平衡而進(jìn)行的長期不轉(zhuǎn)移的懸浮培養(yǎng)。15、次級代謝和次級代謝產(chǎn)物人們把除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白質(zhì)及糖類（這些成分通常稱為初級代謝產(chǎn)物）以外，具有如下特征的成分稱為次級代謝產(chǎn)物：①有明顯的分類學(xué)區(qū)域界限；②其合成需在一定的條件下才能發(fā)生；③缺乏明確的生理功能；④是生命的多余成分?，F(xiàn)代定義：次級代謝作用是特殊蛋白質(zhì)內(nèi)源化合物的合成、代謝及分解作用的綜合體現(xiàn)。上述作用的結(jié)果導(dǎo)致了次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，如生物堿、黃酮體、萜類、有機(jī)酸、木質(zhì)素等。第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展簡史19世紀(jì)上半頁，Schleiden和Schwann提出了細(xì)胞學(xué)說；細(xì)胞是生物有機(jī)體的結(jié)構(gòu)和生命活動的單位，又是生物個(gè)體和系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ)，20世紀(jì)初，德國著名植物學(xué)家Haberlandt依據(jù)細(xì)胞理論，首次提出了高等植物的器官和組織可以不斷分割，直至單個(gè)細(xì)胞的觀點(diǎn)；20世紀(jì)20年代初至30年代，在胚胎培養(yǎng)和器官培養(yǎng)領(lǐng)域中取得了一些成果。Hanning首次在無機(jī)鹽溶液及有機(jī)營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基上成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚，觀察到離體胚均能正常發(fā)育，同時(shí)發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)提早萌發(fā)成苗的事實(shí)。White（1934）建立番茄根無性繁殖系，1939年建立煙草莖切段的培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)。40年代，植物細(xì)胞培養(yǎng)與培養(yǎng)的營養(yǎng)要求相聯(lián)系。Steward發(fā)現(xiàn)椰子汁在胡羅卜組織培養(yǎng)中具有明顯的刺激生長的效應(yīng)。50年代進(jìn)入發(fā)展時(shí)期：（1）Skoog和崔徵發(fā)現(xiàn)腺嘌呤、腺苷能解除培養(yǎng)基中IAA對芽形成的抑制作用。并具有誘導(dǎo)芽形成的能力。確立了腺嘌呤/生長素的比是控制芽和根形成的主要條件，比例高，有利于芽的形成，低有利于根的形成。（2）Miller發(fā)現(xiàn)：激動素Kinetin具有很強(qiáng)的促進(jìn)芽形成能力，提出激動素/生長素比理論。（3）Steward：植物細(xì)胞全能性理論的首次實(shí)驗(yàn)證實(shí)，胡羅卜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)胚狀體，形成完整植株。對培養(yǎng)中細(xì)胞的生長和分化規(guī)律已有所認(rèn)識。第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展簡史六十年代至今為發(fā)展新時(shí)期特點(diǎn)：與現(xiàn)代遺傳學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合，形成體細(xì)胞遺傳學(xué)，細(xì)胞工程學(xué)和植物遺傳工程：（1）花藥培養(yǎng)與單倍體育種。（2）分離原生質(zhì)體新方法和細(xì)胞雜交。（3）植物遺傳工程。自此植物器官與營養(yǎng)需求之間關(guān)系研究、原生質(zhì)體、培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方法的研究獲得了高度重視，基因工程技術(shù)也被用于植物次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中。第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展簡史第三節(jié)植物細(xì)胞的形態(tài)和生理特性一、植物細(xì)胞的形態(tài)植物細(xì)胞的形態(tài)多種多樣，隨植物種類、存在部位和功能的不同而異。游離的或排列疏松的薄壁細(xì)胞多呈球形、類圓形和橢圓形；排列緊密的細(xì)胞多呈角形；具有支持作用的細(xì)胞，細(xì)胞壁常增厚，呈類圓形、紡錘形等；具有輸導(dǎo)作用的細(xì)胞則多呈管狀。植物細(xì)胞大小不一。植物基本組織細(xì)胞體積較大，種子植物薄壁細(xì)胞的直徑在20~100微米之間；儲藏組織細(xì)胞的直徑可達(dá)1mm。苧麻纖維一般為200mm，有的可達(dá)500mm以上。最長的細(xì)胞是無節(jié)乳管，長達(dá)數(shù)米至數(shù)十米不等。二、植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征根據(jù)典型細(xì)胞核的有無可將生物細(xì)胞分為原核細(xì)胞（prokaryoticcell）和真核細(xì)胞（eukaryoticcell）。真核細(xì)胞有典型的、為雙層膜所包被著的細(xì)胞核，原核細(xì)胞中只有類核（nucleoid）。類核沒有核膜包被，常常只有一條DNA，其周圍即為細(xì)胞質(zhì)。高等植物的細(xì)胞均為真核細(xì)胞。與動物細(xì)胞及微生物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞有3個(gè)特點(diǎn)，即具有細(xì)胞壁、液泡和質(zhì)體（如葉綠體）見書中圖。三、細(xì)胞的主要生理活性物質(zhì)及其他化學(xué)組分細(xì)胞中除含有生命的原生質(zhì)體外，還有許多非生命的物質(zhì)，它們均為細(xì)胞代謝過程中的產(chǎn)物。一類是后含物，系儲藏物質(zhì)或廢棄物質(zhì)，分布于液泡內(nèi)，如糖類（saccharide）、鹽類（salts）、生物堿、苷、有機(jī)酸、揮發(fā)油等；另一類為生理活性物質(zhì)，對細(xì)胞內(nèi)生化代謝和生理活動起著調(diào)節(jié)作用，含量雖少，但其生理作用卻非常重要，如酶、維生素、植物激素和抗生素等。1、生理活性物質(zhì)生理活性物質(zhì)是一類對細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)和生理活動起調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)的總稱。包括酶、維生素、植物激素和抗生素等。（1）酶類酶（enzymes）是一種有機(jī)催化劑。酶反應(yīng)一般在常溫、常壓、中性水溶液中進(jìn)行，高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和某些重金屬離子，會使其失活。1、生理活性物質(zhì)（2）維生素維生素（vitamin）是一類復(fù)雜的有機(jī)物，常參與酶的形成，對植物的生長、呼吸和物質(zhì)代謝有調(diào)節(jié)作用，如對難以生根的植物，用維生素B12處理后可促進(jìn)不定根的生長。1、生理活性物質(zhì)（3）植物激素植物激素是植物細(xì)胞原生質(zhì)體產(chǎn)生的一類復(fù)雜的調(diào)節(jié)代謝的有機(jī)物質(zhì)，對生理過程（如細(xì)胞分裂和繁殖）產(chǎn)生作用，其量雖微，但作用甚大。1、生理活性物質(zhì)（4）抗生素和植物殺菌素抗生素（antibiotic）是由微生物（如某些菌類植物）產(chǎn)生的能殺死或抑制某些微生物生長的物質(zhì)，如青霉素、鏈霉素等。高等植物如蔥、蒜、辣椒、蘿卜等也能產(chǎn)生殺菌的物質(zhì)，稱為植物殺菌素（plantfungicidin）。2、其它成分（1）生物堿生物堿（alkaloide）是一類含氮的有機(jī)化合物，廣布于植物界。含生物堿較多的植物科有：茄科、罌粟科、小檗科、豆科、夾竹桃科等。按照植物化學(xué)分類學(xué)的觀點(diǎn)，親緣關(guān)系相近的植物，常含有化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的成分。此外，一種植物所含的同一類成分中也經(jīng)常存在多種化學(xué)成分，如人參中含有幾十種人參皂苷。它們均屬于三萜皂苷類成分。中草藥中含有多種生物堿，如麻黃堿、咖啡、阿托品、喹啉、黃連素等，其生理活性都很強(qiáng)。2、其它成分（2）糖苷類糖苷（glucosides）是指某些有機(jī)化合物和糖經(jīng)苷鍵結(jié)合而成的化合物，例如黃酮苷是黃酮苷元和糖連接而成。很多糖苷類化合物對疾病都有很好的治療作用，如洋地黃毒苷有強(qiáng)心作用；大黃中的蒽醌苷有強(qiáng)烈的瀉下作用；紫草中紫草寧是紫草中蒽醌類化合物的總稱，除作為天然色素（如口紅）外，尚具有很好的抗癌活性。2、其它成分（3）揮發(fā)油揮發(fā)油（volatileoil）是一類具有芳香氣味，在常溫下易于揮發(fā)的油類。在傘形科、姜科、唇形科等植物中多有分布。很多揮發(fā)油可作藥用，如薄荷油、丁香油、桉油等。2、其它成分（4）有機(jī)酸有機(jī)酸（organicacids）是糖類代謝的中間產(chǎn)物。植物果實(shí)中酸味以及細(xì)胞液的酸性反應(yīng)，主要是由于有機(jī)酸的存在。常見的植物有機(jī)酸有：蘋果酸、檸檬酸、水楊酸、酒石酸等。四、植物培養(yǎng)細(xì)胞的生理特性植物培養(yǎng)細(xì)胞不同生長階段的持續(xù)時(shí)間及特征。延遲期（lagphase）細(xì)胞分裂的初始期和最大生長期之間，其持續(xù)時(shí)間取決于培養(yǎng)前的條件、時(shí)期和[培養(yǎng)基性質(zhì)，其特征是細(xì)胞數(shù)量、干重近乎恒定，細(xì)胞壁厚度達(dá)最大；高RNA含量；高蛋白質(zhì)合成能力；高聚核糖體含量；有絲分裂加速；增加細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)部分四、植物培養(yǎng)細(xì)胞的生理特性加速期（accelerationphase）細(xì)胞最大生長期和最大細(xì)胞濃度，最佳DNA濃度和蛋白質(zhì)累積率，持續(xù)時(shí)間3~4代，其特征為常數(shù)：干重增加：細(xì)胞數(shù)、DNA和蛋白質(zhì)濃度減少：有絲分裂活性、RNA含量和蛋白質(zhì)合成能力增加細(xì)胞鮮種、干重及RNA酶活性四、植物培養(yǎng)細(xì)胞的生理特性對數(shù)期（logphase）介于最大生長率和蛋白質(zhì)合成完全停止期之間，其特征為蛋白質(zhì)合成能力減退；變化：聚核糖體濃度向有利于單核糖體和寡核糖體形成的方向減少穩(wěn)定期（stationaryphase）細(xì)胞數(shù)穩(wěn)定，其特征為細(xì)胞高液泡化、極度脆弱、高度分化，有機(jī)化合物的濃度高。四、植物培養(yǎng)細(xì)胞的生理特性由上所述可以知道，植物培養(yǎng)細(xì)胞重量的增加主要取決于對數(shù)期，而次級代謝產(chǎn)物的累積則主要在穩(wěn)定期完成。當(dāng)然植物細(xì)胞與哺乳動物細(xì)胞及微生物細(xì)胞有很多的不容，并由此導(dǎo)致了一系列生理生化等方面的差異，比如混合與傳質(zhì)等。就植物細(xì)胞而言，它們很少以單一細(xì)胞懸浮生長，而多以非均相集合體的細(xì)胞團(tuán)形式存在。根據(jù)細(xì)胞系的來源、培養(yǎng)基及培養(yǎng)時(shí)間等的不同，細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞數(shù)目在2~200之間，直徑為2mm左右。四、植物培養(yǎng)細(xì)胞的生理特性細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)生的原因有兩個(gè)：（1）細(xì)胞分裂之后沒有進(jìn)行細(xì)胞分離；（2）在間歇培養(yǎng)過程中細(xì)胞處于對數(shù)生長后期時(shí)，開始分泌粘多糖和蛋白質(zhì)，或者以其它形式形成粘性表面，從而形成細(xì)胞團(tuán)。植物細(xì)胞形態(tài)上的另一特性，就是其纖維素細(xì)胞壁使得其外骨架相當(dāng)脆弱，表現(xiàn)為抗張力強(qiáng)度大，抗剪切能力小，故傳統(tǒng)的攪拌式生物反應(yīng)器容易損壞植物細(xì)胞的細(xì)胞壁。再者，植物細(xì)胞培養(yǎng)基黏度度比較高，且培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)上升。四、植物培養(yǎng)細(xì)胞的生理特性所有的植物都是好氣性的，因此培養(yǎng)過程中需要不斷地供氧。但是，與微生物細(xì)胞相反，它并不需要很高的氣液傳質(zhì)速率，而是要控制供氧量，以保持較低的溶氧水平。此外，大多數(shù)植物細(xì)胞液體培養(yǎng)的pH為5~7，在此pH水平，通氣速率過高會驅(qū)除二氧化碳而抑制細(xì)胞生長，這個(gè)問題可通過在通氣過程中加入一定濃度的二氧化碳來解決。注意光照的影響。四、植物培養(yǎng)細(xì)胞的生理特性植物細(xì)胞液體培養(yǎng)過程中的泡沫問題不象微生物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)那么嚴(yán)重，泡沫的性質(zhì)也不同。氣泡比微生物培養(yǎng)系統(tǒng)中的大，而且由于其含有蛋白質(zhì)或粘多糖，黏度較大，細(xì)胞極易被包埋在泡沫中，并從循環(huán)的營養(yǎng)液中帶出來，這就造成了非均相培養(yǎng)，通常需要采用化學(xué)或機(jī)械的方法加以控制，否則，隨著泡沫和細(xì)胞數(shù)量的增加，混合和培養(yǎng)過程的穩(wěn)定性就要受到影響。四、植物培養(yǎng)細(xì)胞的生理特性在植物細(xì)胞液體培養(yǎng)過程中，細(xì)胞可能會黏附于培養(yǎng)的反應(yīng)器壁、電極或擋板的表面上。細(xì)胞對表面的黏附及其在器壁上的生長特性，是人們目前正在研究的重點(diǎn)課題之一。通過改變培養(yǎng)基中某些離子的成分，可使表面吸附問題得到一定程度的改善。第四節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)一、植物材料的準(zhǔn)備二、培養(yǎng)基及其組成三、培養(yǎng)方法一、植物材料的準(zhǔn)備用于植物組織培養(yǎng)的外植體，必須是無雜菌材料。微生物在接觸培養(yǎng)基時(shí)會大量繁殖，抑制培養(yǎng)物的生長，因此需滅菌處理。許多化學(xué)試劑均能作為表面滅菌劑使用，原則上應(yīng)盡可能選擇那些滅菌后易于除去或容易分解的時(shí)間試劑。滅菌劑的選擇和處理時(shí)間的長短取決于所用材料對試劑的敏感性。對滅菌劑敏感的外植體的滅菌時(shí)間不宜過長；而不敏感的，滅菌時(shí)間則可適當(dāng)延長。經(jīng)常使用的滅菌劑如下表。常用滅菌劑的效果比較滅菌劑使用濃度/%去除難易程度滅菌時(shí)間/min效果次氯酸鈣次氯酸鈉過氧化氫溴水硝酸銀氯化汞抗生素9~100.5~53~121~210.1~14~50mg/L易易最易易較難較難中5~305~305~152~105~302~1030~60很好很好好很好好最好較好植物不同組織（器官）的滅菌時(shí)間和步驟組織（器官）滅菌步驟備注滅菌前處理滅菌滅菌后處理種子果實(shí)莖切段儲藏器官葉片純酒精中浸10min，再用無菌水漂洗純酒精漂洗自來水洗凈，再用酒精洗自來水自來水，吸干，純酒精100g/L次氯酸鈣浸20~30min，再用10g/L溴水浸5min20g/L次氯酸鈉浸10min20g/L次氯酸鈉浸5~30min20g/L次氯酸鈉浸20~30min1g/L氯化汞浸1min無菌水洗3次，在無菌水中發(fā)芽；或無菌水洗5次，在濕無菌紙上發(fā)芽無菌水沖洗，再剖除內(nèi)部組織的種子無菌水洗3次無菌水洗3次，濾紙吸干無菌水反復(fù)沖洗，濾紙吸干用幼根或幼芽發(fā)生愈傷組織獲得無菌苗選取嫩葉、葉片平放在瓊脂上一、植物材料的準(zhǔn)備植物材料滅菌后，即可進(jìn)行培養(yǎng)。接種的外植體的形狀和大小要根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康募熬唧w情況而定。當(dāng)然，如果所用外植體細(xì)胞多時(shí)，得到愈傷組織的機(jī)會必然也多。如要定量研究愈傷組織，則不僅外植體的大小要一致，而且其形狀及組織部位也應(yīng)基本類似。進(jìn)行這類培養(yǎng)研究常常選用較大材料，如人參、胡蘿卜或甜菜的貯藏根、馬鈴薯的塊莖等。二、培養(yǎng)基的及其組成培養(yǎng)基實(shí)際上是植物離體器官、組織或細(xì)胞等的無菌土壤，其特點(diǎn)是營養(yǎng)成分的可調(diào)控性。植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基種類較多，但通常都含有無機(jī)鹽、碳源、有機(jī)氮源、植物生長激素、維生素等化學(xué)成分。有商品化的培養(yǎng)基可以購買。1、無機(jī)鹽基本培養(yǎng)基是由各種濃度的無機(jī)鹽溶液組成的，這些無機(jī)鹽又有“大量元素”和“微量元素”之分。大量元素是指使用濃度大于30mg/L時(shí)的無機(jī)元素，包括N、S、P、K、Mg、Ca、Cl和鈉，而微量元素是指濃度低于30mg/L的無機(jī)元素，如Fe、B、Mn、I和Mo，以及極微量的Cu和Zn。某些情況下，還可加入Ni、Co和Al。這些微量元素作為輔因子或?qū)γ负铣啥?，都是必須的，如鎳對脲酶的合成就是至關(guān)重要的。2、碳源植物細(xì)胞培養(yǎng)物通常均為異養(yǎng)細(xì)胞。因此人們經(jīng)常使用碳水化合物、肌醇作為碳源，有時(shí)也用甘油、乳糖和半乳糖等化合物。有些培養(yǎng)物還可通過同化二氧化碳而獲得所需的能量，此所謂光自養(yǎng)培養(yǎng)物。在某些情況下，培養(yǎng)基固化劑也可作為補(bǔ)充能量和碳源之用。此外，某些天然提取物對愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)也有重要意義，如椰子乳（椰子的液體胚乳），常用濃度為10%；也可用0.5%的酵母提取物或5%~10%的番茄汁等。3、植物生長調(diào)節(jié)劑植物激素是指植物代謝過程中形成的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在極低濃度（<1M）時(shí)即能調(diào)節(jié)植物的生育過程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運(yùn)到作用部位而發(fā)揮作用。植物激素只限于天然產(chǎn)生的調(diào)節(jié)物質(zhì)，到目前位置，已發(fā)現(xiàn)植物組織中可以形成5種植物激素，即生長素、分裂素、赤霉素、脫落酸和乙烯。植物生長調(diào)節(jié)劑既包括人工合成的具有生理活性的化合物，也包括一些天然的化合物以及植物激素。4、有機(jī)氮源使用較多的有機(jī)氮源為蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物（如谷氨酰胺）或各種氨基酸。有機(jī)氮源對細(xì)胞的早期生長有利，氨基酸的加入主要是為了代替或增加氮源的供應(yīng)，但應(yīng)注意的是蘇氨酸、甘氨酸和纈氨酸可通過滅活位于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)上的谷氨酸合成酶而降低氮的利用，而精氨酸通常具有補(bǔ)償此滅活作用的能力。5、維生素植物細(xì)胞通常是維生素自養(yǎng)型的，但在大多數(shù)情況下，其自身合成的量均不能滿足植物細(xì)胞的需要，即使是光合成活性細(xì)胞或組織也是如此。故對大多數(shù)培養(yǎng)基而言，除了必需加入的B族維生素（如B1、B6和泛酸）外，通常還需加入一定量的生物素和肌醇，后者是構(gòu)成磷酸肌醇（細(xì)胞膜脂質(zhì)部分含磷酸肌醇2%~8%）極性端的部分。三、培養(yǎng)方法植物細(xì)胞培養(yǎng)，按培養(yǎng)對象來說，可分為原生質(zhì)體培養(yǎng)和單倍體細(xì)胞培養(yǎng)；按照培養(yǎng)基類型可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；按培養(yǎng)方式可分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng)。三、培養(yǎng)方法固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩種方法基本上是在微生物培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。所謂固體培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)際上包括利用瓊脂作為支撐物的固體培養(yǎng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng)。固體培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，經(jīng)加熱溶解后，分別裝入培養(yǎng)用的容器中，冷卻后凝結(jié)成固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)的特點(diǎn)是簡便易行、所占空間小。但也有缺點(diǎn)，主要是不均衡現(xiàn)象。固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)互相配合是組織（細(xì)胞）培養(yǎng)的常規(guī)操作。常用的固化劑有瓊脂、藻酸鹽（alginate）、角叉藻聚糖（carrageenan）、明膠（gelatin）、羥乙基纖維素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅膠等。最常用的凝固劑是瓊脂，最適濃度0.6~1.0%。三、培養(yǎng)方法溫度是培養(yǎng)中重要的因素，一般控制在251℃之間。有些植物材料在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)需要在黑暗條件下進(jìn)行，但誘導(dǎo)愈傷組織的器官分化和其他材料的培養(yǎng)都需要光照。光照以每天16h為宜。由于植物組織在培養(yǎng)基上生長要不斷消耗營養(yǎng)、散失水分和累積代謝物，必將影響培養(yǎng)物的進(jìn)一步生長。因此外植體在培養(yǎng)三周左右必須轉(zhuǎn)換至新鮮培養(yǎng)基上，以保持正常生長。移換一次培養(yǎng)基稱一次繼代培養(yǎng)。一種外植體經(jīng)過一定次數(shù)的繼代培養(yǎng)，其培養(yǎng)物就可用于懸浮培養(yǎng)。三、培養(yǎng)方法液體培養(yǎng)系統(tǒng)包括小規(guī)模的懸浮培養(yǎng)和大規(guī)模的成批培養(yǎng)、半連續(xù)和連續(xù)培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)可分為靜止和振蕩兩類。靜止液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)一樣，也具有簡便易行的特點(diǎn)，而且培養(yǎng)基還不會產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)濃度差的現(xiàn)象。振蕩液體培養(yǎng)，是使懸浮細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中，并不斷振動下進(jìn)行培養(yǎng)。這樣可以防止上述靜止培養(yǎng)的許多缺點(diǎn)。通常培養(yǎng)基的體積約占容器體積的20%。三、培養(yǎng)方法1、成批培養(yǎng)法將培養(yǎng)基一次性地加入反應(yīng)器，接種、培養(yǎng)一定時(shí)間后收獲細(xì)胞的操作方式稱為成批培養(yǎng)法。植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，次級代謝產(chǎn)物的大量累積往往發(fā)生在細(xì)胞生長的穩(wěn)定期，人們基于此原理設(shè)計(jì)了植物細(xì)胞的兩步培養(yǎng)法，即使用兩個(gè)生物反應(yīng)器，第一個(gè)反應(yīng)器用于細(xì)胞生物量的累積，第二個(gè)反應(yīng)器用于次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。三、培養(yǎng)方法2、半連續(xù)培養(yǎng)法在反應(yīng)器中投料和接種培養(yǎng)一段時(shí)間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行交換的培養(yǎng)方法稱為半連續(xù)培養(yǎng)法。3、連續(xù)培養(yǎng)法利用連續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)器，在投料和接種培養(yǎng)一段時(shí)后，以一定速度連續(xù)采集細(xì)胞和培養(yǎng)液，并以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基以使細(xì)胞生長環(huán)境長期維持恒定的方法。三、培養(yǎng)方法4、固定化培養(yǎng)法植物次級代謝產(chǎn)物的累積主要在細(xì)胞生長的穩(wěn)定期，表明細(xì)胞成塊而趨于分化時(shí)，細(xì)胞塊中各個(gè)細(xì)胞處于一定理化梯度之下，此現(xiàn)象與完整植株類似，由此人們提出了植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)技術(shù)。固定化培養(yǎng)采用的固定化反應(yīng)器有網(wǎng)狀多孔板、尼龍網(wǎng)套和中空纖維膜等多種類型，將細(xì)胞固定于尼龍?zhí)變?nèi)，或固定于中孔纖維反應(yīng)器的膜表面，或固定于網(wǎng)狀多孔板上，放入培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，或連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)及連續(xù)收集培養(yǎng)產(chǎn)物，也可通入凈化空氣以代替攪拌。優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞位置固定，易于獲得高密度細(xì)胞群體及維持細(xì)胞間的物理化學(xué)梯度，利于細(xì)胞組織化，易于控制條件。第五節(jié)影響植物次級代謝產(chǎn)物累積的因素在植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)過程中，影響植物次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生和累積的因素主要有：①生物條件：外植體、季節(jié)、休眠、分化等；②物理?xiàng)l件：溫度、光（光照時(shí)間、光強(qiáng)、光質(zhì)）、通氣（O2）、pH和滲透壓等；③化學(xué)條件：無機(jī)鹽（N、P、K等）、碳源、植物生長調(diào)節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物質(zhì)、前體等；④工業(yè)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)罐類型、通氣、攪拌和培養(yǎng)方法等。一、外植體選擇不同外植體的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物，其最大次級代謝產(chǎn)物的累積時(shí)間各異。同一化合物可以在不同外植體的不同生長階段中累積，有的次級代謝產(chǎn)物累積是在延遲期進(jìn)行，有的則在加速期累積，當(dāng)然也有的累積時(shí)間與細(xì)胞生長曲線同步，，還有的則在穩(wěn)定期大量累積次級代謝產(chǎn)物。二、培養(yǎng)條件的影響1、培養(yǎng)環(huán)境的內(nèi)在因素（1）接種和誘導(dǎo)：外植體的大小不僅影響所誘導(dǎo)的組織和細(xì)胞的生長，而且也關(guān)系到其次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力，如長春花培養(yǎng)物中蛇根堿的合成要求其外植體直徑在1~12cm之間，在此條件下才能分泌噻吩類成分。次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率與外植體大小、細(xì)胞密度及營養(yǎng)成分密切相關(guān)，如在紫草的細(xì)胞培養(yǎng)中，當(dāng)營養(yǎng)成分的供給為1400mg/L時(shí)，細(xì)胞干重為2.8g/L。然而，細(xì)胞生長率的增加有時(shí)會導(dǎo)致次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的降低。外植體的大小可能是使某些次級代謝產(chǎn)物含量發(fā)生變化的原因之一，此類現(xiàn)象常見于一些高產(chǎn)細(xì)胞株經(jīng)繼代培養(yǎng)之后。前處理也可影響累積方式。二、培養(yǎng)條件的影響1、培養(yǎng)環(huán)境的內(nèi)在因素（2）基本培養(yǎng)基組成：基本培養(yǎng)基的各種成分是愈傷組織和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，尤其在穩(wěn)定期次級代謝產(chǎn)物累積時(shí)更是如此。①磷：低的含磷量常常導(dǎo)致次級代謝產(chǎn)物的累積，缺乏磷；又可導(dǎo)致生物量的大幅度減低②氮：有些利用NO3-有些利用NH4+，有些需兩者，有些需要某些特殊有機(jī)氮源，如天冬氨酸、尿素、酪蛋白水解物、蛋白胨等。含氮化合物的數(shù)量和種類對次級代謝產(chǎn)物的合成有很大的影響。③銅：作為許多酶、蛋白、以及一些含-SH,-OH基的化合物的活性基團(tuán)，是次級代謝產(chǎn)物累積的必要元素。（3）碳源：碳源通常以光自養(yǎng)培養(yǎng)中的CO2或異養(yǎng)培養(yǎng)中的糖類兩種形式提供，其性質(zhì)和數(shù)量往往對培養(yǎng)細(xì)胞的生物量有很大的影響。CO2可以誘導(dǎo)某些特征反應(yīng)，如在金蘋果的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中，高濃度CO2可產(chǎn)生一種特有的蘋果香味。植物細(xì)胞培養(yǎng)中使用最多的碳源是糖類，對次級代謝產(chǎn)物的影響主要取決于所使用的糖類的種類及細(xì)胞次級代謝產(chǎn)物的生物合成過程。碳源對長春花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中次級代謝作用的影響次級代謝產(chǎn)物糖類乳糖（6%）蔗糖（3%）甘露糖醇（0.3~0.6mol/L）長春花堿/mg?L-1蛇根堿/mg?L-1游離氨基酸/mol?L-150————16.601.400.55——21.502.86（4）植物生長調(diào)節(jié)劑植物生長調(diào)節(jié)劑在植物細(xì)胞培養(yǎng)中起著非常重要的作用，這種作用有時(shí)可能是關(guān)鍵性的。但是植物材料和生理狀態(tài)的差異，無一定的規(guī)律可循，必須通過仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)觀察才能確定其合適的數(shù)量和種類。如Furuya在培養(yǎng)煙草細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，加入IAA時(shí)培養(yǎng)物中有尼古丁生成，但2，4-D存在時(shí)則不合成該化合物。說明不同植物激素及其不同組合形式均可顯著影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。（5）O2和pH①O2：培養(yǎng)細(xì)胞生長過程需要維持其正常呼吸作用，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)供氧方式有所不同，前者可采用攪拌和通氣方式，攪拌速度通常為120~160r/min，過快易導(dǎo)致細(xì)胞破裂；后者僅能采用通氣方式，一般使用含5%CO2的潔凈空氣，通氣量應(yīng)適當(dāng)，過多或過少均影響細(xì)胞生長及次級代謝產(chǎn)物的合成。②pH：一般來說，最有利于培養(yǎng)細(xì)胞生長的pH在5~6之間。常用的培養(yǎng)基均具有一定的緩沖性質(zhì)，在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液的pH變化較小。（6）滲出物（exudates）：在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)后期，培養(yǎng)液中常含有各種代謝產(chǎn)物，如某些初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物以及某些酸性物質(zhì)、醇類、水解蛋白或活性蛋白等。如落花生懸浮培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的后期培養(yǎng)液中含有27種多肽成分。此外，培養(yǎng)細(xì)胞分泌產(chǎn)物的量也取決于培養(yǎng)物的發(fā)育階段，如在多葉羽扁豆懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中，在活躍的生長期初期，酶的分泌量就達(dá)到了穩(wěn)定期的水平，爾后酶活性隨乙醇量的增加而降低。次級代謝產(chǎn)物的累積往往在水解酶活性增加之前進(jìn)行。2、兩步培養(yǎng)法培養(yǎng)基的組成是細(xì)胞生長和次級代謝產(chǎn)物的形成最直接、也是最重要的影響因素。為了得到最佳生長和最佳次級代謝產(chǎn)物，提出了兩步法。第一步主要使用適合細(xì)胞生長的培養(yǎng)基，稱為生長培養(yǎng)基（growthmedium）第二步主要用適于次級代謝產(chǎn)物合成的培養(yǎng)基，稱為生產(chǎn)培養(yǎng)基。

兩種培養(yǎng)基往往有較大的區(qū)別，前者是為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高生產(chǎn)率，后者通常具有較低含量的硝酸鹽和磷酸鹽，并含有較低的糖份或較少的碳源。書中介紹了長春花細(xì)胞培養(yǎng)中生長培養(yǎng)基與生產(chǎn)培養(yǎng)基的區(qū)別主要為前者使用了肌醇及維生素類成分，而后者則不含上述成分，在生長調(diào)節(jié)劑的使用上，前者應(yīng)用2，4-D刺激細(xì)胞生長，而后者加入6-BA以便利于次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。3、培養(yǎng)環(huán)境的外部因素（1）溫度培養(yǎng)物中次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的最佳溫度為20~28℃。在一定溫度（≤15℃）下，細(xì)胞不再生長，次級代謝產(chǎn)物也不再產(chǎn)生。但應(yīng)該指出的是，在某些極端情況下（如30℃），細(xì)胞也能正常生長。終產(chǎn)物和中間產(chǎn)物的累積，甚至與其生物合成直接相關(guān)的化合物，也并非需要相同的溫度。低溫對次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的影響類似于2，4-D的抑制作用。當(dāng)培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)物正常生長所要求的溫度相差很大時(shí)，可引起某些應(yīng)激效應(yīng)以及對次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的激活作用。溫度的變化尚可引起產(chǎn)物類型在質(zhì)和量上的改變，個(gè)別情況下由于激活了新的生物合成途徑也可能產(chǎn)生新的代謝物質(zhì)。4、培養(yǎng)環(huán)境的外部因素（2）攪拌頻率植物培養(yǎng)細(xì)胞的產(chǎn)率與發(fā)酵罐的攪拌速度有關(guān)，具體表現(xiàn)在發(fā)酵液中的溶氧濃度和機(jī)械攪拌對細(xì)胞所產(chǎn)生的剪切力上，如上述因素對海巴戟長方形細(xì)胞（累積蒽醌類成分）、產(chǎn)生甜菜苷（betanine）的甜菜（Betavulgaris）細(xì)胞和累積蛇根堿的長春花細(xì)胞等的影響就非常明顯。但攪拌頻率也不宜過小，如低于28r/min時(shí)，次級代謝產(chǎn)物的生物合成反應(yīng)就有可能發(fā)生反轉(zhuǎn)。4、培養(yǎng)環(huán)境的外部因素（3）培養(yǎng)容器的影響植物培養(yǎng)細(xì)胞次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生可因?yàn)樗门囵B(yǎng)容器的大小和攪拌裝置的不同而得到不同的結(jié)果。如小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)所用的培養(yǎng)容器（50~500ml）具有較高的氧轉(zhuǎn)移率，通過簡單的定期攪拌，培養(yǎng)物的每個(gè)部位均可得到比大規(guī)模培養(yǎng)更好的氧供應(yīng)。用于生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物反應(yīng)器中的攪拌器對細(xì)胞產(chǎn)率可產(chǎn)生一定的影響，這些差異及由剪切力引起的不良影響可通過使用氣升式發(fā)酵罐或一個(gè)沿水平軸轉(zhuǎn)動的發(fā)酵罐而予以避免。但因?yàn)橹参锛?xì)胞生長和次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)過程是完全分離的，所以這對細(xì)胞生產(chǎn)過程會有不利影響。延長穩(wěn)定期就意味著延長培養(yǎng)時(shí)間，從而增加成本、增大污染機(jī)會等，可以通過兩步培養(yǎng)等方法解決。4、培養(yǎng)環(huán)境的外部因素（4）光的影響光照時(shí)間、光質(zhì)和光強(qiáng)對次生代謝產(chǎn)物（如黃酮、黃酮醇、花色素苷、揮發(fā)油等）的累積都有一定影響。第六節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器要研制適合于高等植物細(xì)胞大量培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，首先應(yīng)對植物細(xì)胞的特性有所了解。植物細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)借鑒了微生物發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)，但植物細(xì)胞和微生物相比存在著很多差異：植物細(xì)胞的直徑為10m~100m，比細(xì)菌和真菌細(xì)胞大10~100倍；植物細(xì)胞的纖維素壁具有較差的抗剪切能力；植物細(xì)胞的呼吸率低，對氧的需求也低。此外，植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)與各類植物細(xì)胞的不同生理特征和代謝方式有關(guān)，同時(shí)也與培養(yǎng)方式相聯(lián)系。反應(yīng)器的選擇取決于生產(chǎn)細(xì)胞的密度、通氣量以及所提供的營養(yǎng)成分的分散程度。根據(jù)通氣和攪拌系統(tǒng)的類型可將生物反應(yīng)器分為以下幾類：①搖瓶②攪拌型生物反應(yīng)器③環(huán)流生物反應(yīng)器和鼓泡塔生物反應(yīng)器。目前主要用于植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應(yīng)器有一、機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器